5-醛基胞嘧啶的标记方法及其在单碱基分辨率测序中的应用

本项目采用化学生物学手段，筛选出特异性成环标记5-醛基胞嘧啶（5fC）的化合物——叠氮茚二酮和丙二腈，并且标记产物在随后的PCR扩增过程实现胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的转变，可实现全基因组5-醛基胞嘧啶的单碱基分辨率检测。用叠氮茚二酮标记作为标记化合物，可实现对含有5-醛基胞嘧啶DNA片段的先富集再测序，将测序成本大大降低。用生物相容性很好的丙二腈作为标记化合物，可实现单细胞水平的5-醛基胞嘧啶单碱基分辨率检测。血液中细胞外游离DNA上的核酸修饰可以作为人类癌症的生物标记物，本项目涉及的核酸修饰检测技术，不会造成DNA降解，适应于临床小量珍贵样品，在癌症的液态活检上具有重大潜力。

本项目实现免亚硫酸氢盐的5-醛基胞嘧啶全基因组单碱基分辨率检测，研究成果可以直接用于开发5-醛基胞嘧啶检测试剂盒。同时，将本发明与5-羟甲基胞嘧啶的特异性氧化结合起来，可用于开发5-羟甲基胞嘧啶的检测试剂盒。另外，本项目也可应用于作为疾病生物标记物的核酸修饰的检测。

运用本项目中的叠氮茚二酮作为化学标记物，测定了小鼠胚胎干细胞的5-醛基胞嘧啶单碱基分辨率图谱，验证了本项目用于全基因组5-醛基胞嘧啶单碱基分辨率检测的可行性（Nature methods，2015）。利用本项目中的丙二腈用于化学标记物，实现了5-醛基胞嘧啶的单细胞单碱基分辨率检测，并且测定了小鼠早期胚胎的5-醛基胞嘧啶图谱（Cell Stem Cell，2017）。利用化学氧化剂将5-羟甲基胞嘧啶特异性氧化成5-醛基胞嘧啶，然后利用本项目的标记反应，实现了免亚硫酸氢盐的5-羟甲基胞嘧啶全基因组单碱基分辨率检测。研究表明人细胞外游离DNA的5-羟甲基胞嘧啶可作为癌症液态活检的生物标记物，将本项目应用于人细胞外游离DNA上的5-羟甲基胞嘧啶的检测，在世界上首次获得了人细胞外游离DNA的5-羟甲基胞嘧啶单碱基分辨率图谱，并且结果显示通过本项目参与的核酸修饰检测可以将癌症病人与正常人区分开（J. Am. Chem. Soc. 2018）。