研发阶段/n一种猪蓝耳病基因重组猪霍乱沙门氏菌疫苗及应用。　　成果简介：沙门氏菌是一种胞内寄生的革兰氏阴性肠道杆菌，具有侵袭性。减毒沙门氏菌为载体的基因工程疫苗具有无法比拟的优越性，口服该种基因工程疫苗可以在激发产生抗沙门氏菌免疫应答的同时诱发特异性针对外源蛋白的体液和细胞免疫。猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪呼吸道疾病的高度接触传染病，可对猪场造成巨大的损失。本发明涉及一种猪蓝耳病基因重组猪霍乱沙门氏菌疫苗及应用，属于动物细菌基因工程技术领域，具

01. 成果简介 中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）是2012年在中东地区首先发现的一种新型冠状病毒，与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）同属于β冠状病毒，能够引发严重的人类呼吸系统疾病。据世界卫生组织的最新统计表明，MERS-CoV已造成全球27个国家2428例感染，致死率高达35%。 MERS-CoV表面刺突蛋白（Spike）蛋白是病毒颗粒与细胞受体二肽基肽酶4（DPP4）作用的关键蛋白，也是MERS-CoV疫苗与保护性单克隆抗体研究的热门靶点。本项目团队在靶向刺突蛋白的高活性中和抗体筛选、鉴定、分子结构研究中取得了一系列突破。本团队在国际上首批报道了两株人源MERS-CoV中和抗体MERS-4与MERS-27，它们均能高效抑制假病毒与活病毒对体外培养细胞的侵染，在动物模型中也显示了很好的保护作用。该团队还综合运用结构生物学、生物化学以及病毒学研究方法阐明了这两株抗体识别Spike受体结合结构域（RBD）的不同位点，并阻断Spike与受体DPP4的结合。 本项目团队还利用一种稀有黑猩猩腺病毒AdC68为载体，搭载MERS-CoV表面全长的Spike蛋白，在转基因小鼠（hDPP4-KI）模型中，一次滴鼻免疫即可诱导产生长期保护性免疫反应，并完全预防小鼠感染或降低感染后的疾病进展速度。解决了目前研发的MERS-CoV疫苗大多需要进行多次免疫注射的复杂程序问题。进一步的抗体分析表明，免疫动物血清中含有广谱高滴度针对RBD的多克隆和单克隆中和抗体，能够有效阻断病毒与受体DPP4的结合，从而解析了其长期保护性免疫反应的分子基础和机制，为疫苗下一阶段进入大动物模型和人体临床试验做好了准备。                        MERS-CoV及其相关中和抗体和疫苗研究时间轴AdC68-S重组疫苗在hDPP4-KI转基因小鼠模型上的保护效果02. 应用前景 本项成果可应用于治疗或预防中东呼吸综合征冠状病毒的抗体药物及疫苗候选物。03. 知识产权 本项成果已申请4项发明专利，其中3项已授权。04. 团队介绍 本项目团队由生命学院实验室与医学院实验室联合组成，两位实验室负责人分别为清华大学生命学院和医学院教授、博士生导师，主要研究方向分别为结构生物学与病毒学，已发表国内外高水平学术论文数十篇，联合申请专利4项。05.合作方式 技术许可。06.联系方式 邮箱：zhangxinrui@tsinghua.edu.cn

该成果 2011 年、 2013 年先后获连云港市科学技术进步二等奖、一等奖。项目实施的核心技术为水产养殖动物细菌病诊断技术与免疫技术，形成了较为完善的水产养殖动物疾病诊断和防控的技术体系。 包括（1） 环介导恒温扩增技术（LAMP），（2） 黄芪佐剂水剂型灭活疫苗及卵黄抗体疫苗。

中试阶段/n该项目针对现行国家认定的喹乙醇残留标示物 3-甲基喹噁啉-2-羧 酸，首次制出标准品，研究制订了畜禽和水产动物可食性组织及产品中 残留检测方法标准 2 种，在国内外首次研制出基于抗体的 ELISA 试剂盒及试纸条 3 种。这些方法标准及产品已纳入国家兽药残留监控计划，在 全国得到广泛应用。采用放射性示踪和液质联用技术，在国内外首次全 面系统地研究了喹乙醇在大鼠、猪、鸡和鱼体内的吸收、分布、代谢和排泄规律，发现了 9 种新代谢产物，重新确定了喹乙醇在猪、鸡和鱼体

随着世界养猪业的发展，规模化饲养技术的应用和饲养高度密 集，以及突发腹泻因素存在，使得猪腹泻病日趋流行，危害日渐严重。猪传染 性胃肠炎与流行性腹泻在养猪场引起猪腹泻病的报道屡见不鲜，特别是规模化 猪场在受到蓝耳病、圆环病等感染之后免疫功能下降时，猪腹泻类病伺机暴发， 导致较严重的经济损失。本成果是利用自主分离鉴定猪传染性胃肠炎与流行性 腹泻病毒，通过基因工程的方法，在乳酸菌中进行表达，通过优化培养工艺， 提高乳酸菌的培养密度，混合研制的多价口服疫苗，用于该类疾病的免疫预防。 该产品的开发为该病的防控起到重要作用，具有重要的应用价值和经济效益。 

可以量产/n本成果根据糖皮质激素类药物的化学结构和理化性质，探索了样品预处理、分离和检测技术，在国内外首次建立能同时定量和确证检测猪、牛、羊的肝脏和肌肉、鸡蛋和鸡肉及牛奶共9种组织和产品中8种药物(泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、氟氢可的松、甲基泼尼松、倍氯米松、氢化可的松)残留的液相色谱-串联质谱法。该方法对各化合物在各种组织中的定量限为0.2?g/kg~4?g/kg，回收率60%-90%，批间异系数5.1%~12.6%。己作为国家标准，在全国农业、质检和卫生系统的数十家检验测试中心广为应用

研发阶段/n本成果采用了菌种和培养基分离的方法，主要试剂均以工作液形式提供，解决了传统微生物方法稳定性差的问题；在测定样品时，只需将棉拭子插入组织样品，样品前处理简单，整个测定过程由6h缩短为5h，适合高通量的样品筛选；对磺胺类药物的灵敏度低，适用于定性检测动物组织样品中多种磺胺类药物残留；操作方法方便易行、灵敏度高、简单、快速，将会为磺胺类药物残留的监控提供有力的保障。技术水平：专利技术（国家发明专利授权号：ZL2006100186472）应用前景：本成果克服了现有技术灵敏度低、检测时间长、操作费

本研究成果是立足我国蛋白质饲料资源短缺、人畜争粮、畜禽对饲料蛋白质利用率低以及动物粪便中含氮物质排放污染环境等现实问题，开展的以提高饲料蛋白质消化率、减少粪尿氮排放，和提高饲料蛋白质资源利用率为主要目标的系列研究，获 2012 年江苏省科学技术三等奖。该成果提高反刍动物生产率 5-10%、 N 素减排 5-7%。

该成果 2013 年获农业部中华农业科技奖二等奖。主要针对严重影响我国畜牧业生产的反刍动物微量元素缺乏病、骨营养不良性疾病和奶牛围产期代谢应激等进行深入研究，在系统分析这些疾病的流行病学规律和发病机理的基础上，建立了防控的关键技术并在生产中应用。思路新颖，技术难度大，创新性强，社会经济效益显著。成果整体达到同类研究的国际先进水平，在动物骨营养不良性疾病发病机理和硫辛酸调控高产奶牛围产期代谢应激的关键技术等方面达到国际领先水平。