01.成果简介 CRISPR/Cas9是细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统。其工作原理是crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。经过研究，通过人工设计tracrRNA/crRNA，改造形成具有引导作用的sgRNA，可以引导Cas9蛋白在多种细胞的特定基因组位点上进行切割、修饰，并最终实现基因突变、插入或缺失。因此，CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用于基因编辑技术领域。 近年来，CRISPR/Cas9基因编辑系统在真核生物和原核生物中得到了广泛的应用。在大肠杆菌等革兰氏阴性菌中，用一个载体表达cas9基因，同时由于革兰氏阴性菌重组效率低，需要在这个载体上表达λ-RED重组酶；在另一个载体中表达sgRNA和用于同源重组的同源臂序列。两个载体都转入大肠杆菌中时，sgRNA介导Cas9蛋白切割基因组上特定序列，形成双链断裂，刺激同源重组的发生，从而实现基因编辑。 本项成果构建了适用于盐单胞菌的基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统。该系统由两个载体组成：第一个载体表达Cas9基因，且不需要表达λ-RED重组酶，实际操作中不再需要诱导λ-RED重组酶的表达，简化了步骤流程；第二个载体表达sgRNA，并含有用于同源重组的同源臂序列。从而实现了基因编辑。本项成果的技术优势包括： （1）基因编辑时间由原有的20余天缩短到7-8天； （2）N个基因编辑时间由原有的N个月缩短到3+5N天； （3）无需表达λ-RED重组酶。                        图1 盐单胞菌TD01进行基因编辑的流程示意图02.应用前景 本项成果可作为CRISPR/Cas9基因编辑系统的载体，广泛应用于基因编辑领域。03.知识产权 本项成果已申请1项发明专利。04.团队介绍 本项目为多团队合作项目，其中一个团队的负责人为清华大学教授，博士生导师，长江学者特聘教授，国家杰出青年基金获得者。主要研究方向为合成生物学、微生物代谢工程、生物材料、工业生物技术。已发表国内外高水平学术论文数十篇，申请专利70余项。05.合作方式 投融资。06.联系方式邮箱：zhangxinrui@tsinghua.edu.cn

选择标记转基因作物已成为近年来植物基因工程技术研究的重点之一，随着转基因作物产品的商品化，转基因植物的生物安全性受到公众越来越多的关注，尤其是目前抗生素标记基因在植物遗传转化过程中的广泛应用，使人们对这些标记基因可能带来的潜在危害性心存疑虑，抗性标记基因的存在严重地阻碍了转基因植物的商品化进程和转化技术本身的有效性。 本项目培育的无抗生素标记基因（可视化标记基因）在建立高效、安全、规模化的转基因作物技术体系方面取得突破，以紫色幼芽作为可视筛选标记代替抗生素筛选标记，构建了新型转化载体

选择标记转基因作物已成为近年来植物基因工程技术研究的重点之一，随着转基因作物产品的商品化，转基因植物的生物安全性受到公众越来越多的关注，尤其是目前抗生素标记基因在植物遗传转化过程中的广泛应用，使人们对这些标记基因可能带来的潜在危害性心存疑虑，抗性标记基因的存在严重地阻碍了转基因植物的商品化进程和转化技术本身的有效性。 本项目培育的无抗生素标记基因（可视化标记基因）在建立高效、安全、规模化的转基因作物技术体系方面取得突破，以紫色幼芽作为绿 脓可视筛选标记代替抗生素筛选标记，构建了新型转化载体并应用于作物，已申请 2 项发明专利。

基因治疗现已成为攻克肿瘤最具希望，也是研究最为活跃的领域。基因导入系统是基因治疗的核心技术。现阶段面临的最大难题在于尚未找到理想的基因载体，治疗基因的导入仍然是肿瘤基因治疗的瓶颈。非病毒载体近年来发展迅速，其中聚乙烯亚胺(polyethylenimine PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体。 本项目针对聚乙烯亚胺（PEI）转基因载体使用中存在的转染效率与细胞毒性相矛盾及靶向性差等问题，采用生物可降解技术、金属离子配位技术等连接低分子量聚乙烯亚胺(LMW PEI)，得到多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物，进而选择肿瘤主动靶向多肽RGD、tLype-1等，与细胞穿膜肽TAT(49-57)、核定位信号肽NLS连接，合成具有多功能的数种功能肽RGDC-TAT、RGDC-TAT-NLS、tLype-1-NLS等，利用交联技术将多功能与PEI衍生物偶联，从而构建新型非病毒基因载体系统，旨在保证较高转染效率情况下，降低PEI细胞毒性，增加其对肿瘤的靶向性，克服当前非病毒基因载体的瓶颈问题，为基因治疗探索一条有效途径。 本项目受国家自然科学基金、上海市科委国际学术合作项目及上海市教委科研创新项目资助，发表学术论文数十篇，申请发明专利10项，其中授权7项。

已有样品/n成功将全长的西妥昔单抗基因分别克隆至腺病毒载体AdC68和Hu5，构建重组腺病毒AdC68-CEb和Hu5-CEb，通过WesternBlot4证明成功表达了西妥昔单抗；我们进一步通过夹心ELISA对表达的西妥昔单抗进行了定量，产量分别为639g/L和522g/L；同时，我们通过间接免疫荧光证明了所表达的西妥昔单抗与EGFR结合的特异性；并通过MTT实验证明了AdC68-CEb和Hu5-CEb显著抑制结直肠癌细胞的生长，而对正常细胞没有抑制作用；动物实验显示，用AdC68-CEb和Hu5

基因治疗通过纠正患病细胞基因缺陷或者调控细胞内特定蛋白因子的表达，在攻克威胁人类健康的重大疾病（如癌症，帕金森等）方面展现出广阔的应用前景。但核酸分子在递送过程中非常容易被酶降解，因此缺乏高效的基因载体材料已成为基因治疗的最大障碍。本工作通过将廉价低分子量阳离子聚合物（如，聚乙烯亚胺和聚赖氨酸等）修饰上一种生物体内可还原的金属配位单元，得到一种高效安全的锌配体修饰阳离子聚合物基核酸载体材料。 项目特色: 本项目具有制备简单，生产成本低，基于该材料的基因载体复合物对多种细胞系具有极高的转染效率，且细胞毒性小，具有很强的抗血清能力。该产品对多种细胞系在转染性能上显著优于目前市场上商品化主流转染试剂。该项目技术已申请国家发明专利。

已有样品/n目前在临床上，两种PD-1单抗的使用剂量为2-3mg/kg，每2-3周静脉输入，历时30-60分钟。使用剂量大且频繁。同时，单克隆抗体的制备、纯化过程繁琐，要求严格，导致单抗的价格昂贵，使受益于该单抗的病人在接受治疗时受到极大限制。由于腺病毒制备、纯化简单、产量高、安全性好、外源表达时间长等特点，因此我们研发的腺病毒表达PD-1单抗制备简单、成本低、疗效好、使用方便，可充分满足临床病人的需求。我们研发的重组腺病毒载体表达PD-1单抗为临床相关肿瘤的治疗与研究提供了一种有效的新手段，并具有

活载体疫苗是指对细菌、病毒、真菌等微生物进行基因改造，保留其基本入侵宿主细胞引起免疫反应的能力，降低其对宿主造成危害毒力，之后通过外源插入疫苗靶点基因等方法建立起来的一种新型疫苗。近年来团队在对常见肠道致病菌致病机理研究的基础上，筛选了单增李斯特菌做为载体菌，对其关键毒力基因进行敲除构建稳定减毒突变株用来表达外源基因。目前团队已构建了双基因敲除株疫苗载体、半致死载体等活载体疫苗运载系统，并对其进行抗原递呈、免疫机理等进行了初步研究发现，该类疫苗载体对免疫因子具有强烈的激活效应，更为重要的是该类活载体

本发明属于医药及生物工程领域，涉及一种可用于艾滋病基因治疗的 CRISPR/Cas9 重组慢病毒载体 及其慢病毒，该重组慢病毒载体由慢病毒载体 lentiCRISPR 用 BsmBI 酶切后，连入带 BsmBI 粘性末端 的 CXCR4 特异靶序列重组而得，获得的 CRISPR/Cas9 重组慢病毒载体能够在艾滋病毒辅助受体 CXCR4 的 4&nbs

本成果提供了一种包含特定 RNAi 片段的可有效控制水稻黑条矮缩病的专用载体，将该载体转入水稻获得的转基因水稻对黑条矮缩病毒近乎免疫， 生长全程均不需要采取对该病毒病的任何防治措施。