本发明涉及猪ApoE基因敲除载体及其构建方法与应用，本发明的载体命名为pApoEKO-DTA-M，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO : 1所示，其构建方法包括如下步骤：(1)扩增猪ApoE基因侧翼序列作为基因打靶的长臂和短臂；(2)短臂与打靶载体ploxp分别酶切、连接后，再与长臂连接；去除tk，与dta基因片段连接；(3)在长短臂之间插入特异性启动子Cre，构建得到ApoE基因敲除载体。本发明的猪ApoE基因敲除载体可用于培育敲除了ApoE基因的猪，用于动脉硬化模型动物的制备。

该技术涉及一项基于聚苯乙烯基的载体高分子微球的生产技术。产品经改性后，可获得表面带-Cl、-NH3等功能性基团的微球。 

1 成果简介荧光与核素在体小动物成像系统是在国家 863 计划的支持下研制的世界首台小动物在体（活体）分子成像系统。该系统具有同时实现荧光断层成像与正电子发射断层成像(PET)的双模式信息融合分子影像检测功能，可以以 3D 方式显示活动物体内任何位置的特定细胞和分子事件。在该系统中，发展了旋转扫描式动物在体全景成像检测技术和断层扫描三维重建技术，有效解决了伽玛光子信息采集与荧光图像获取相互干扰的难题，同时提高了荧光的检测深度；通过研发的光子漫射理论逆向算法，提高在体检测的空间分辨率和空间定位精度，结合 PET 深层透视的优点，可以 3D 方式显示活动物体内任何位置的特定细胞和分子事件。目前拥有 12 项专利。 该平台采用荧光和核素双模标记的检测方法和技术，研究者可以在一次实验活动中同时获取荧光、 PET 及双模融合的多种数据，并进行分析，从而可以更好更为全面地理解疾病产生的机理，研究药物的作用机制，也可以分析疾病耐药的发生过程，以及药效的持续时间等。研究人员能够使用该系统实时监测活体动物内部器官、组织与细胞、基因蛋白分子等不同层面的动态变化信息，开展在体水平的生命科学与医学科研和应用研究工作。例如，研究肿瘤和癌细胞在体生长、分化、凋亡、转移、扩善，药物在细胞、组织、器官层面的输送、扩散、代谢与定点释放，药物作用下体内肿瘤或癌细胞的生长、凋亡变化，以及与各种疾病相关的分子、细胞、组织的动态变化情况。 （ 1） 肿瘤小鼠荧光图像 （ 2）荧光与 PET 断层图像 上图 荧光与 PET 双模成像 系统特点：荧光与 PET 同时双模成像；动物在体 360゜全景无遮挡扫描成像；支持常规荧光或 PET 成像，也可以采集双模数据；荧光活体成像超越常规的浅表成像，支持 FMT 及小动物深度组织的成像。2 应用说明应用领域：药物研发和筛选；病理机理与病毒研究；新一代分子影像药物研发；药物代谢过程， 基因治疗效果及药效评价。

纳米氮化硼材料兼具氮化硼和纳米材料的双重优势，广泛应用于航空航天、高端电子散热材料、吸附剂、水净化、化妆品等领域。项目团队开发出一种能够实现形貌和尺寸均一且具有超大比表面积多孔氮化硼纳米纤维的规模化制备技术，目前市场尚未实现规模化生产。该技术合成工艺简单可控、成本低、过程绿色环保，处于国际领先地位。 1 产品的应用领域 图2 高性能氮化硼纳米纤维粉体 图3 氮化硼纳米纤维粉体微观形貌

针对肿瘤缺氧所致PD-1抗体不敏感，本项目利用白蛋白及ROS响应链接子将PD-1抗体与富氧血红蛋白（Hb）及ATO包裹成纳米颗粒。 一、项目进展 创意计划阶段 二、负责人及成员 姓名 学院/所学专业 入学/毕业时间 张琰 第二临床医学院/临床医学 2019.9/2024.6 梁洛绮 第一临床医学院/临床医学 2018.9/2023.6 三、指导教师 姓名 学院/所学专业 职务/职称 研究方向 侯鹏 第一临床医学院 副主任/教授 肿瘤生物学 杨琪 第一临床医学院 副主任/副教授 肿瘤生物学 四、项目简介 目前，尽管晚期肿瘤免疫治疗取得巨大突破，仍有大量患者对PD-1抗体不敏感。主要原因是实体肿瘤灌注不良，缺氧、酸化，抑制免疫。阿托伐醌（ATO）为线粒体Complex III抑制剂，能有效降低组织氧耗改善缺氧，但生物利用率低毒性大，应用受限。针对肿瘤缺氧所致PD-1抗体不敏感，本项目利用白蛋白及ROS响应链接子将PD-1抗体与富氧血红蛋白（Hb）及ATO包裹成纳米颗粒。研究结果证实该颗粒能肿瘤局部富集，链接子遇肿瘤微环境高含量ROS解离释放Hb 、ATO及PD-1抗体，瘤细胞对ATO的利用提高，氧耗降低。此外，Hb氧递送实现多途径改善缺氧，显著提高PD-1抗体疗效，具有潜在医学转化价值。

本成果采用最新的深度学习和分子模拟算法，结合新一代分子特征化方法，开发了多种计算机模型，可用于药物开发中的多个阶段，为药物的快速设计开发提供一个完整的基于人工智能的解决方案。成果：1.药物毒性预测方法：传统的化合物毒性检测技术一般需要使用生化试验、细胞实验、甚至动物模型，这些方法不仅耗费大量时间，而且成本很高。使用计算模型进行有机化合物的毒性预测，所需投入较少，但产出巨大。特别是基于化合物的物理化学和结构特性的计算模型，甚至能够在化合物合成之前就对其进行预测，大大提高了效率，使其越来越受到欢迎。在进行体外和体内试验之前先使用计算机模型对化合物进行大规模的毒性筛选，能够更好地解决候选药物具有毒性的问题。我们建立了一套新的基于多种分子指纹和机器学习算法的化合物毒性预测集成学习算法，运用此集成学习算法建立了新的有机化合物致癌性、致突变性和肝毒性预测模型。我们分别建立了名为CarcinoPred-EL (http://112.126.70.33/toxicity/CarcinoPred-EL/, 致癌性预测)、MutagenPred-EL (http://112.126.70.33/toxicity/MutagenPred-EL/, 致突变性预测)、LiverToxPred-EL (http://112.126.70.33/toxicity/LiverToxPred-EL/, 肝毒性预测)的预测服务器，这些服务器能够为使用者提供更高效更便捷的预测技术服务。自2017年服务器发表起，我们已为国内外药物分子设计研究者提供了5000多次共计超过20多万个化合物的毒性预测服务。在有机化合物毒性预测研究方向，我们主要完成了化合物的细胞毒性、心脏毒性、生殖毒性、血脑屏障透过性、水生生物毒性预测模型，以及糖尿病早期筛查模型的开发，正在进行P450酶阻滞剂性预测模型、基于图神经网络的毒性预测算法研究、基于分子对接的化合物毒性预测研究等。相关研究成果已发表多篇学术论文（Zhang L., et al. Scientific Reports, 2017, 7: 2118. WOS被引次数80，ESI 1%高被引论文；Ai H., et al. Toxicological Sciences, 2018, 165: 100-107；Yin Z., et al. Journal of Applied Toxicology. 2019, 39(10): 1366-1377；Ai H., et al. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2019, 179: 71-78；Liu M., et al. Toxicology Letters. 2020, 332: 88-96；Feng H., et al. Toxicology Letters. 2021, 340: 4-14；Li S. et al. Interdisciplinary Sciences: Computational Life Sciences. 2021, 13: 25-33.）致癌性预测服务器首页致癌性预测结果页相关综述对本服务器的介绍RF-hERG-Score预测药物引起的hERG相关心脏毒性2.药物设计方法：在计算机上对药物靶点和药物分子的结构和活性建模，计算药物与靶点之间的相互作用关系，从而设计出具有治疗作用的药物。计算机辅助药物设计可以为药物设计各阶段的实验方案提供有意义的指导，减少需要通过实验评估的候选药物的数量，从而加快新药研发速度。我们应用分子对接、分子动力学模拟、自由能计算、机器学习等方法研究流感病毒等重要疾病的计算机辅助药物设计、并开发更有效的计算机辅助药物设计方法。在计算机辅助药物设计研究我们主要完成了流感病毒M2质子通道蛋白抑制剂虚拟筛选方法研究，正在进行先导化合物生成模型研究、基于机器学习的虚拟筛选打分函数算法开发、SARS-CoV-2病毒S蛋白与受体相互作用及药物设计研究。特异性重打分函数显著虚拟筛选性能显著较高筛选出两个候选抑制剂3.药物靶点识别方法：长非编码RNA（lncRNA）是一种长度在200nt至100,000nt之间的非编码RNA，是转录物的主要成分。研究表明lncRNA在许多生物学和病理学过程中起着重要作用。lncRNA起作用的重要途径是与其靶蛋白结合。lncRNA-蛋白质相互作用的实验研究需要大量资源。累积的实验数据使得通过计算方法预测lncRNA-蛋白质相互作用成为可能。我们使用各种数学建模和机器学习方法开发了几种用于预测lncRNA-蛋白质相互作用的新模型。这些模型命名为：RWLPAP（随机游走），LPI-NRLMF（邻域正则化逻辑矩阵分解），IRWNRLPI（集成随机游走和邻域规则化Logistic矩阵分解），LPI-BNPRA（双向网络投影推荐算法），LPI-ETSLP（基于特征值变换的半监督链路预测），HLPI-Ensemble（集成学习）。在交叉验证中，我们的模型获得了较好的预测性能。lncRNA-蛋白质相互作用预测模型的性能比较lncRNA-蛋白质相互作用预测服务器相关软件著作权：

本成果采用最新的深度学习和分子模拟算法，结合新一代分子特征化方法，开发了多种计算机模型，可用于药物开发中的多个阶段，为药物的快速设计开发提供一个完整的基于人工智能的解决方案。 成果：1.药物毒性预测方法：传统的化合物毒性检测技术一般需要使用生化试验、细胞实验、甚至动物模型，这些方法不仅耗费大量时间，而且成本很高。使用计算模型进行有机化合物的毒性预测，所需投入较少，但产出巨大。特别是基于化合物的物理化学和结构特性的计算模型，甚至能够在化合物合成之前就对其进行预测，大大提高了效率，使其越来越受到欢迎。在进行体外和体内试验之前先使用计算机模型对化合物进行大规模的毒性筛选，能够更好地解决候选药物具有毒性的问题。我们建立了一套新的基于多种分子指纹和机器学习算法的化合物毒性预测集成学习算法，运用此集成学习算法建立了新的有机化合物致癌性、致突变性和肝毒性预测模型。我们分别建立了名为CarcinoPred-EL (http://112.126.70.33/toxicity/CarcinoPred-EL/, 致癌性预测)、MutagenPred-EL (http://112.126.70.33/toxicity/MutagenPred-EL/, 致突变性预测)、LiverToxPred-EL (http://112.126.70.33/toxicity/LiverToxPred-EL/, 肝毒性预测)的预测服务器，这些服务器能够为使用者提供更高效更便捷的预测技术服务。自2017年服务器发表起，我们已为国内外药物分子设计研究者提供了5000多次共计超过20多万个化合物的毒性预测服务。在有机化合物毒性预测研究方向，我们主要完成了化合物的细胞毒性、心脏毒性、生殖毒性、血脑屏障透过性、水生生物毒性预测模型，以及糖尿病早期筛查模型的开发，正在进行P450酶阻滞剂性预测模型、基于图神经网络的毒性预测算法研究、基于分子对接的化合物毒性预测研究等。相关研究成果已发表多篇学术论文（Zhang L., et al. Scientific Reports, 2017, 7: 2118. WOS被引次数80，ESI 1%高被引论文；Ai H., et al. Toxicological Sciences, 2018, 165: 100-107；Yin Z., et al. Journal of Applied Toxicology. 2019, 39(10): 1366-1377；Ai H., et al. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2019, 179: 71-78；Liu M., et al. Toxicology Letters. 2020, 332: 88-96；Feng H., et al. Toxicology Letters. 2021, 340: 4-14；Li S. et al. Interdisciplinary Sciences: Computational Life Sciences. 2021, 13: 25-33.） 致癌性预测服务器首页 致癌性预测结果页 相关综述对本服务器的介绍 RF-hERG-Score预测药物引起的hERG相关心脏毒性 2.药物设计方法：在计算机上对药物靶点和药物分子的结构和活性建模，计算药物与靶点之间的相互作用关系，从而设计出具有治疗作用的药物。计算机辅助药物设计可以为药物设计各阶段的实验方案提供有意义的指导，减少需要通过实验评估的候选药物的数量，从而加快新药研发速度。我们应用分子对接、分子动力学模拟、自由能计算、机器学习等方法研究流感病毒等重要疾病的计算机辅助药物设计、并开发更有效的计算机辅助药物设计方法。在计算机辅助药物设计研究我们主要完成了流感病毒M2质子通道蛋白抑制剂虚拟筛选方法研究，正在进行先导化合物生成模型研究、基于机器学习的虚拟筛选打分函数算法开发、SARS-CoV-2病毒S蛋白与受体相互作用及药物设计研究。 特异性重打分函数显著虚拟筛选性能显著较高 筛选出两个候选抑制剂 3.药物靶点识别方法：长非编码RNA（lncRNA）是一种长度在200nt至100,000nt之间的非编码RNA，是转录物的主要成分。研究表明lncRNA在许多生物学和病理学过程中起着重要作用。lncRNA起作用的重要途径是与其靶蛋白结合。lncRNA-蛋白质相互作用的实验研究需要大量资源。累积的实验数据使得通过计算方法预测lncRNA-蛋白质相互作用成为可能。我们使用各种数学建模和机器学习方法开发了几种用于预测lncRNA-蛋白质相互作用的新模型。这些模型命名为：RWLPAP（随机游走），LPI-NRLMF（邻域正则化逻辑矩阵分解），IRWNRLPI（集成随机游走和邻域规则化Logistic矩阵分解），LPI-BNPRA（双向网络投影推荐算法），LPI-ETSLP（基于特征值变换的半监督链路预测），HLPI-Ensemble（集成学习）。在交叉验证中，我们的模型获得了较好的预测性能。 lncRNA-蛋白质相互作用预测模型的性能比较 lncRNA-蛋白质相互作用预测服务器相关软件著作权：

目前主流的抗菌膜制备方法是在基膜表面接枝抗菌物质，常用的抗菌材料包括氧化石墨烯、碳纳米管、抗菌聚合物、金属离子等，但这些材料普遍存在着接枝方式复杂，且对环境有危害的缺陷。相比而言，季铵盐类抗菌剂具有抗菌效果好，环境友好等特点，目前水溶性的小分子或高分子季铵盐抗菌剂已经广泛应用于水处理、食品、医疗卫生和包装材料等领域。然而，将季铵化合物直接接枝到膜表面所制备的抗菌膜仍存在制备流程复杂，成本较高等问题，这也使得目前开发的大部分季铵盐功能膜无法大规模应用于实际水处理系统。因此，为解决以上问题，开发新型亲水抗菌功膜的制备方法是目前业内所亟需的。 本成果中提出的制备方法将氯甲基化聚合物制备为中空纤维多孔膜，并制作为管壳式膜组件，之后采用过滤操作模式直接将叔胺化合物接枝到组件中的中空纤维膜丝上，从而制备出具有优良抗菌性能的季铵化功能膜组件。该制备方法简单便捷，且接枝稳定性高，适合长期大规模应用于实际膜法水处理体系中，且制备的超滤膜具有良好的亲水性和抗菌性。抗菌膜制备简单便捷，常温常压过滤操作即可完成接枝，且接枝稳定性高，成本低，对水体中微生物去除率99.9%以上，尤其能抑制微生物在膜上（内外表面，孔道壁面）生长。 图1.性能参数

现有问题：现有的血红蛋白类携氧载体（HBOCs）主要为小分子修饰血红蛋白、交联剂聚合血红蛋白以及包裹血红蛋白。这些HBOCs制品的毒副作用在动物实验和I, II, III期临床试验均有报道。正是基于临床试验中发现的HBOCs引起高血压反应及增加病人心肌梗死的风险，2009年美国FDA拒绝了Northfield公司HBOCs产品（PolyHeme）的上市请求。现有HBOCs制品输注后的毒副反应，主要是由于HBOC中游离或未聚合的血红蛋白，包括氧合或非氧合状态，透过内皮屏障，消耗内皮舒张因子一氧化氮（NO）；同时，血红蛋白本身的氧化还原反应，生成的氧自由基造成机体氧化应激反应。 项目的创新性和优越性：? 本项目制备的新型携氧纳米粒子，完全不同于现有HBOCs制品，首先在纳米粒子中包裹一定剂量的抗氧化剂，有效减少输注血红蛋白氧载体后可能产生的氧自由基。然后，通过结合珠蛋白将血红蛋白稳定连接到纳米粒子外膜。结合珠蛋白能与游离血红蛋白结合成稳定的复合物，一方面避免了体内过量的游离血红蛋白出现，减少输注后缩血管效应引起的高血压现象和胃肠道反应；另一方面，结合珠蛋白本身也可作为还原剂，减少血红蛋白引起的氧化应激反应。?该新型携氧纳米粒子体内的代谢方式为纳米粒子崩解后，结合珠蛋白/血红蛋白复合物经网状内皮系统清除，可大大减轻经肾脏排泄可能造成的肾损伤。?现有HBOCs类制品，特别是聚合血红蛋白和包裹血红蛋白，往往包含数量不等的血红蛋白，分子量处于一定范围，而且，还有部分游离血红蛋白或未反应血红蛋白并不能完全清除，这也是产生毒副作用的一大诱因。而本项目的携氧纳米粒子表面带有数量可控的活性官能团，因此，可实现血红蛋白的定点定量结合，得到分子量稳定的终产物。?现有的第三代HBOCs制品，大多用高分子材料将血红蛋白包裹，输注入人体后很难避免“突释”效应，出现大量游离血红蛋白，有可能对机体造成很大的伤害。而本项目所述的新型携氧纳米粒子，血红蛋白与结合珠蛋白形成了稳定的复合物或者血红蛋白与高分子材料牢固结合，即使纳米粒子分解之后，也不会产生大量游离血红蛋白，因此可大大减少相关风险。该新型携氧纳米粒子可以冻干粉末的形式保存，保存期长，稳定性高，运输方便，可满足各种环境下的应急使用和临床常规应用。?使用的高分子载体为聚乙二醇-聚酯类共聚物。聚乙二醇（PEG）由于其本身不带电荷、水溶性、无免疫原性、可以防止材料表面生物污染、减少蛋白质吸附和细菌贴附、并且不易被免疫体系识别等、且它在体内能溶于组织液中，能被机体迅速排出体外而不产生任何毒副作用的特点，是修饰纳米粒子的理想材料。聚乙二醇的存在还可以有效屏蔽人体网状内皮系统对纳米粒子的吞噬和排异，延长粒子在血液中的循环时间。可生物降解且生物相容性良好的聚酯（聚己内酯/聚乳酸，PCL/PLA），无毒无刺激性，已经得到美国食品药品监督管理局（FDA）的认证用于人体治疗。

本发明公开了一种制备胶体金标记的装载有PD药物的纳米脂质体的方法。将卵磷脂；胆固醇乙醇溶液在特定条件下分散到含胶体金和左旋多巴或金刚烷胺PD治疗药物的PBS溶液中，再将该溶液置于水浴中搅拌，乙醇挥发完全之后适当超声制备而成。所制备的胶体金标记的装载PD药物纳米脂质体粒径小、稳定性好，且有金定位标记，可增加PD药物的稳定性，提高生物利用率，同时减少药物用量，降低毒性。制备方法操作简便，反应易控制。产物可用于研究纳米左旋多巴或金刚烷胺脂质体的给药效果，改善左旋多巴或金刚烷胺的毒副作用，增强脑靶向性，还可作为一种探针用于研究纳米脂质体的脑代谢途径。