益生优良芽孢杆菌是一类能对热、紫外线、电磁辐射等有强抗性的微生物。其独特优势可用来制成新型、高效、低残留的微生态制剂，广泛应用于工业、农业、医学等研究领域。目前，国内外益生芽孢杆菌产业化关键技术存在诸多问题。如：产品中活菌数低；有效期内活菌含量低造成货架期短；研发与生产脱节，研发单位工程技术应用相对滞后。针对当前问题，本技术攻克了芽孢杆菌发酵集成技术，包括： （1）N+离子诱变结合荧光探针追踪：利用低能离子注入技术对芽孢杆菌进行改良，筛选出性状优良的菌种。通过荧光探针追踪芽孢杆菌培养

益生芽孢杆菌因其独特的优势可用来制成新型、高效、低残留的微生态制剂，广泛应用于工业、农业、医学等科学研究领域。目前，国内外益生芽孢杆菌产业化关键技术存在诸多问题。如：活菌数低、出芽率低、货架期短、生产工艺研究不够深入、产品稳定性差等。 项目组在完成系列国家及省部级项目基础上，经过十几年的研究，攻克了芽孢杆菌发酵集成技术，主要包括：N+诱变结合荧光探针追踪，筛选出性状优良的菌种；多阶段发酵与高密度培养结合，大幅提高菌体密度、芽孢出芽率及菌体适应环境能力；构建图像采集，发明新型反应器，进一步优化菌体生长条件；将反应分离耦合技术应用于发酵，解除发酵过程中产物对菌体生长及体内酶活力的抑制作用，实现高浓度的发酵、提高芽孢出芽率、降低产物分离能耗、简化产物分离过程。 创新优势： 项目组采用专利技术生产研发系列益生芽孢杆菌：蜡样芽孢杆菌活菌数由2亿cfu/g提高到8亿cfu/g，符合市售要求并高于农用微生物菌剂国家标准(GB20287-2006)3倍以上；芽孢形成率达到了89.02%，比国内最高提高33.6%，发酵周期21天，比国内最短时间缩短38.2%；凝结芽孢杆菌活菌数由0.5亿cfu/g提高到12亿cfu/g；地衣芽孢杆菌活菌数由10亿cfu/g提高到13亿cfu/g。筛选出海藻糖、聚乙二醇400、吐温80、谷氨酸钠及甘油5种芽孢保护剂，延长芽孢半衰期45%以上，对菌体活性起到良好的保护效果。在示范区内应用，病害抑制率达89%。项目生产的蜡样芽孢杆菌粉参照标准WS-10001-(HD-0902)-2002，检验为类白色粉末，干燥失重为3.3%，小于7.0%，异常毒性符合规定，霉菌小于10个/克，低于标准规定100个/克，未检出控制菌，活菌数为731亿/克，达到国家规定的质量检测标准。 申请国家发明专利17项，授权14项；发表论文59篇，SCI收录43篇；出版专著5部。

凝结芽孢杆菌是一种可以产乳酸的芽孢杆菌，具备乳酸菌的肠道调理功能，又具有芽孢杆菌的抗逆性。用于畜禽养殖，能达到保健康、促增重、降粮耗的作用。凝结芽孢杆菌已列入农业微生物饲料添加剂目录。 项目自主筛选得到一株性能优良的凝结芽孢杆菌；采用液体发酵工程，200产品性能稳定，不含杂菌；通过工艺优化，实现了高效制备。已完成了 30 吨发酵罐级别的试制，发酵液菌体浓度最高为 200cfu/mL，通过精制形成 100--10000 亿 cfu/g 规格的菌粉产品。

（一）蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌NJYH63305是团队自行筛选的有益芽孢杆菌，广泛应用于农业、医药、食品保健、饲料等领域。在农业领域，是一种集抑菌、杀虫、促生于一体的环境友好型高效生防制剂，对茶轮斑病菌、黄瓜枯萎病菌、立枯丝核菌、烟草赤星病菌、茶云纹叶枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦纹枯病、尖镰孢菌、镰刀菌、终极腐霉菌等植物病害及小菜蛾具有较强抑制作用。在医药领域，可调节人体肠道微生态平衡，适于治疗急慢性痢疾、肠炎、腹泻、婴幼儿腹泻引起的肠功能紊乱等；在食品保健领域，可作为食品添加剂，长期服用能促进营养物质的消化吸收，减少肠道疾病的发生，提高免疫能力、增强抗病能力。 1、蜡样芽孢杆菌国内外研究进展目前，国内外蜡状芽孢杆菌研究大多处于实验室内研究阶段，其商品化并应用于农业防治的实例较少。国内市场上蜡样芽孢杆菌农用制剂大部分为复配试剂，同时其大规模培养过程中也存在不少问题，如发酵放大过程信息采集困难、制剂有效期不长、产品货架期短等，这些问题的深入研究对解决蜡样芽孢杆菌高密度培养瓶颈、降低蜡样芽孢杆菌生产成本、促进细胞大规模培养领域重大突破具有重要意义。2、本课题组技术优势（1）团队以项目为纽带，建立了蜡样芽孢杆菌在线监控的高密度培养与多阶段发酵集成技术，在1000L发酵罐上蜡样芽孢杆菌活菌数高达800亿个/g, 比初始培养提高了230%，达国际领先水平；（2）筛选的芽孢保护剂，可提高蜡样芽孢杆菌活性，延长半衰期40％以上；（3）协同江苏省农科院及南京农业技术推广站进行绿色防控技术推广，于江苏浦口林大蔬菜基地、江宁区湖熟街道设施蔬菜基地、溧水傅家边茶厂等地建立2800亩示范区，重点试验核心区460亩。推广示范区内，蜡样芽孢杆菌对水稻纹枯病、灰霉病、晚疫病等真菌病害抑制率达51.8％～85.9％，与苏云金芽孢杆菌（Bt）进行增效试验，小菜蛾杀灭率提高29%，降低化学农药使用量50％以上，农药残留量低于国家无公害农产品标准；（4）目前已在国内外重要期刊发表学术论文10余篇，出版专著《高效有益微生态制剂开发与利用——蜡样芽孢杆菌》，申请国家发明专利4项，授权3项，其中3项（ZL200910028025.1、ZL201010579133.0、ZL200910028320.7）在南京新百药业有限公司成功实现转化。（二）凝结芽孢杆菌团队自行筛选获得一株益生凝结芽胞杆菌NJYHHWG 877005，除具有和乳酸菌及双歧杆菌同样的保健功效外，还具有耐酸、耐热、耐盐、容易培养和保存的特点。凝结芽孢杆菌为兼性厌氧菌，进入肠道后会消耗游离氧，有利于厌氧微生物乳酸菌和双歧杆菌的生长，多用于调节肠道内微生态菌群平衡，团队自主知识产权的凝结芽胞杆菌NJYHHWG 877005对甜瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、西瓜炭疽病菌等有很强的防治效果，可进行新型高效生物农药的开发。

该成果是从土壤中分离出的一株对消除人、畜禽排泄物产生的恶臭气体具有独特作用的菌株。该菌种添加剂加于饲料中不仅具有其他饲用芽孢杆菌的功用和安全性好、稳定性好的特性，而且对减少动物排泄物恶臭作用显著。 适量添加巨大芽孢杆菌添加剂有效降低了蛋鸡排泄物中的脲酶、尿酸酶活性，减少了氨氮、尿酸、总氮及总硫的浓度，进而减少了氨气和硫化氢气体的释放量，改善畜舍环境，促进蛋鸡对营养物质的利用率；可以减少生长肥育猪粪氨气的释放量。

低聚糖、多糖具有较低的代谢能（1 kcal/g），在食品加工中可作为填充剂 部分替代脂肪、蔗糖或淀粉，提高产品的感官特性、储藏性能及调节机体能量代 谢等功能特性，是一类具有促进肠道健康功能的益生元，可以调节肠道氧化应激， 促进益生菌增殖，提高体液免疫和细胞免疫功能，改善机体血脂代谢。 目前，聚糖的制备主要依赖于天然资源的提取、水解和衍生。天然资源的生5 长周期性和提取工艺的复杂性严重制约了聚糖产业的发展。 微波技术在有机合成中已多有应用，我们研究发现微波辅助杂多酸催化技术 可用于制备低聚糖、巨寡糖，采用该技术在特定微波和物料条件下，10 分钟内快 速合成了高得率（90%以上）的低聚葡萄糖、低聚甘露糖、低聚木糖、葡-半乳聚 糖、类虫草多糖等产品。比较分析目前食品加工中使用的聚糖化学结构、营养功 能，发现微波固相合成聚糖具有一致的化学和生物学性能。

本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌、其筛选方法、制剂及应用。所述蜡样芽孢杆菌，具有高效土霉素降解能力，按照如下方法筛选：(1)取受土霉素污染的猪粪菌悬液，在含有 400μg/ml 至 500μg/ml 的放线菌酮的培养基中培养出细菌单菌落；(2)不断提高培养基中土霉素的浓度，保留能适应的细菌单菌落；(3)将上述细菌单菌落，加入无机盐培养基培养，不断提高土霉素浓度，保藏土霉素降解率不低于 50％且 OD600 不低于 0.2 的细菌。所述制剂包括质量比例为 1：4 至 1：5的所述芽孢杆菌干粉和有机基质。所

1.痛点问题 表面活性素是一种枯草芽孢杆菌脂肽，分子结构含7个氨基酸环肽及13-16个碳链长度的脂肪酸，作为脂肽家族生物表面活性剂的代表性分子，具有优异的表面/界面活性、稳定性及抑菌、杀虫等性能。因此，其在石油开采、工农业、医药、日化等领域展现出了非常广阔的应用前景。 但发酵产率低严重制约了表面活性素的工业化生产和应用。研究表明，野生菌株的产量通常为1g/L以下。培养基和培养条件优化后，产量提高也很有限。菌株的基因工程改造方面也比较困难。表面活性素（脂肽）合成机制为特殊的非核糖体肽合成机制，基因簇很大，长度达到26Kb以上。因此很难实现异源表达，只能进行基因组原位突变改造。其分子结构中既包含氨基酸、也包括脂肪酸，因此代谢途径也很复杂。此外，发酵培养过程中，严重的起泡和泡沫溢出问题也制约了工业化的进程。 2.解决方案 化工系于慧敏教授团队从南海底泥等特殊环境中筛选获得了产表面活性素野生枯草芽孢杆菌，进一步采用原位编辑超强启动子工程、特点氨基酸和脂肪酸代谢工程和营养细胞-芽孢调控综合策略，成功构建高产表面活性素的无休眠枯草芽孢杆菌超级细胞工厂，并进一步打通了高产表面活性素新工艺，获得了表面活性素液体和粉末产品。 3.合作需求 本项目寻求有志于在石油开采、工农业、日化洗涤等不同应用领域进行脂肽（表面活性素）新产品开发的企业开展合作，尤其是在上述不同领域具有孵化资源或资金，在工程化、产品化所需的场地、实验条件等方面具有生产和销售优势或经验的企业。也寻求对不同应用场景具有共同开发兴趣的企业开展技术合作。最后，也希望与一些高科技园区进行对接，推动产品生产线建设。

该发明属于兽用微生物添加剂制备技术应用领域，涉及一株缓解畜禽应激的枯草芽孢杆菌选育及应用。该发明从禽源分离筛选的对养殖动物常见肠道致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有明显的抑菌效果的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HDRaBS1。生物功能验证表明该菌株具有抗逆性强和抗应激等特点，可用于制备抗畜禽应激的微生物制剂，其中的制剂包括畜禽饲用微生物添加剂。还公开了该枯草芽孢杆菌HDRaBS1的分离鉴定方法及其在畜禽用单菌剂制备中的应用。 近些来，饲添抗生素的滥用严重影响养殖业的健康可持续发展；同时现代集约化养殖方式的推广，使得因生产环境、饲养管理、运输及病原菌的感染等因素引起的应激时常发生，饲养畜禽因应激而导致的疾病就十分常见，损失巨大。因此该技术的应用将有效减少抗生素的用量，有效提高动物的抗应激能力，保障畜禽健康，具有广阔的应用前景。 转化条件：液体发酵设备、场地400平方，300万 成果完成时间：2014年