该项目 成功 构建 了 一株高 产碱 性果 胶 酶的毕 赤酵 母工 程 菌 (Pichia pastoris GS115),通过对发酵过程的优化控制，在 3L 罐中酶活达到 890U/mL。 在此基础上进行了碱性果胶酶的中试及其工业化研究，在 10 吨发酵罐中产酶达到 1305U/mL.采用该重组碱性果胶酶代替传统的强碱高温工艺，废水 COD 显著降低，可生化性较大提高。处理体系 pH 值为 9.4，代于碱精练水平；酶处理温度低于碱处理，这些结果对棉织物前处理的清洁生产具有重要的应用价值。 

本发明达到的技术效果为工程化酿酒酵母菌可实现无需添加异源前体物或底物仅通过培养微生物即可从头合成高效人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七苷R1等三种齐墩果烷型稀有人参皂苷以及金盏花苷E。 一、项目分类 关键核心技术突破 二、技术分析 人参皂苷Ro 是人参的主要活性成分之一，具有多种药理、生理活性,在人参中含量较低（约0.4%），无法满足日益增长的市场需求，而利用微生物从头合成人参皂苷Ro则可以有效解决该问题，颠覆传统的获取方式，然而合成途径未知，目前尚未有利用微生物从头合成的报道。 本发明技术方案：1.通过生物信息学分析，对现有数据库中的多种植物基因组、转录组数据进行分析和比对，初步筛选候选基因，再结合前期经验和实验基础通过进化树分析、同源建模、分子对接、保守序列分析等手段，确定最终的候选基因；2.通过酶工程等手段，对候选基因进行重组表达、体外酶活验证、底物谱验证等，挑选最合适的酶；3.通过合成生物学、代谢工程、分子生物学相关技术手段，对相关酶进行质粒构建、底盘宿主代谢网络调控、异源途径整合，最终成功构建人参皂苷Ro微生物细胞工厂。 本发明解决了人参皂苷Ro天然代谢途径未知、异源途径与底盘宿主适配性、已报道相关酶活性低等关键技术问题。本发明达到的技术效果为工程化酿酒酵母菌可实现无需添加异源前体物或底物仅通过培养微生物即可从头合成高效人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七苷R1等三种齐墩果烷型稀有人参皂苷以及金盏花苷E。 本发明创新点包括：1.通过基因挖掘手段获得的关键酶性能远远优于已报道的酶；2.通过基因挖掘手段获得的多个关键酶，实现了人参皂苷Ro的合成途径构建；3.首次实现了利用微生物从头合成人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七苷R1等三种齐墩果烷型稀有人参皂苷以及金盏花苷E。 齐墩果烷型稀有人参皂苷，由于其丰富且具备一定特殊性的药理、生理活性，可作为现有人参皂苷市场的强力补充，应用前景广阔。而其天然含量极低，利用微生物对其进行从头合成可大大降低生产成本与产物分离纯化难度，减少有机试剂用量，不依赖植物种植，周期更短，符合国家绿了环保、可持续发展的硬性要求，微生物绿色制造是当前的政策导向也是发展的必然趋势。

该技术利用不同食用菌子实体或加工副产物，制作不同功效的食用菌系列 冻干方便菌汤，适用于食品加工企业、冻干食品加工企业、果蔬加工企业。解 决了生鲜果、菜、菌加工副产物综合高效利用问题；将生鲜果、菜、菌的营养 与保健功效与糕点、面点相结合，改善和提高了普通糕点及面食制品的营养与 功能；增加了糕点及面食制品的花色品种，以满足消费者的多样化需求。该技 术可直接对生鲜果、菜、菌加工副产物进行湿法打浆利用，省去了脱水干燥与 粉碎工序，简化了工艺流程，降低了加工能耗。通过打发顺序的调整和有关配 料的应用，提高了制品的性能，保护了原料中的营养与功效成分。

本实用新型涉及一种乳酸菌复合菌剂的制备装置，包括外箱体，外箱体顶部设置有蒸汽接口，外箱体内上部设置有上端开口的原料箱，原料箱通过管道连接有位于其下方的混合箱，混合箱两端均通过转轴转动固定在固定板上，混合箱底部设置有凸轮，凸轮连接有位于外箱体外的驱动装置，混合箱通过管道连接有菌种箱和培养箱，菌种箱通过管道与培养箱相连，菌种箱连接有伸出外箱体外的接种管，培养箱底部设置有加热装置，加热装置与控制器相连；本实用新型通过将原料箱、混合箱、菌种箱和培养箱均设置在外箱体内，方便进行蒸汽灭菌消毒，保证培养过程中的无菌无氧环境，凸轮驱动混合箱摇晃，避免传统搅拌叶污染培养液的隐患。

本项目涉及功能性醋酸菌/乳酸菌及其发酵调控技术，可用于果蔬饮品、酵素、新型调味品的发酵制造。水果、蔬菜等农产品由于其保质期短，运输成本高，较适宜于在原产地或产地附近进行深加工，以延长保质期及产品附加值。发酵类果蔬饮品由于经过微生物处理，在口味、质地以及营养成分等方面均得到了显著改善，其中果蔬类益生菌类发酵饮品，更是得到关注健康的消费人群的青睐。然而目前市场中的发酵果蔬汁类产品，鱼龙混杂，很多产品存在发酵程度不高；高度依赖后调配；微生物混乱及发酵过程控制不科学；食品安全性不能得到保障等问题。 针对这一类型的产品，本项目从发酵菌种、发酵工艺、功能成分分析以及产品标准化等方面系统的进行了研发。 1）丰富的菌种：本课题组拥有近百株背景明确、安全可靠、发酵性能优良 的微生物，形成了完备的酿造用菌种库，包括乳酸菌、醋酸菌、酵母菌、米曲霉等。可以针对不同的发酵原料以及最终产品口感及质构的要求，选择一种益生菌或复合发酵菌种，实现个性化的定制需求。 2）科学工艺：通过科学的发酵工艺及过程控制，实现了乳酸菌等微生物的高密度培养，活菌数可达 100 亿/ml。大幅降低生产成本和周期，混菌发酵可由几个月缩短至 10 天内，乳酸菌发酵缩短至 24 小时内。实现高效的物质转化，总酸可以达到 6%，提高产品品质及生产稳定性。 3）成分分析：建立了完备的发酵产品成分分析技术平台。针对与产品风味、以及肠道调节、增强免疫等健康功能紧密相关的有机酸、短链脂肪酸、多酚、多肽等功能成分进行精确定量分析以及健康功能评价。 4）产品风味: 本课题组研发的果蔬发酵产品口味浓郁、发酵特色明显，无不良异味。避免了发酵后的过度调配及添加剂的使用，即可达到较优的感官要求。符合健康、绿色的现代加工食品的需求。 

农业生产中许多病害发生、发展严重，目前在生产中仍以化学防治为主，由于田间化学用药次数的提高，病菌已产生明显的抗药性。如番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起的，是番茄生产中的主要病害，严重影响番茄的产量及品质。由于缺乏抗灰霉病的抗原材料，通过常规方法很难育成番茄灰霉病的抗性品种。传统的化学防治不仅高残留、高污染，且对叶围有益微生物区系造成破坏，自然抗病能力进一步减弱。随着人们生活水平的提高，对番茄等果蔬产品的品质要求越来越高，绿色和有机食品逐渐成为消费市场的主流，市场潜力巨大。在食品安全、环境保护、农业可持续发展的时代潮流下，研发新型生物农药逐步取代化学农药已成为农业生产的重要目标，也是经济和社会发展的必然趋势。 利用生防微生物及其次生代谢产物是生物防治的重要手段，我国和世界上许多国家已有商品化微生物农药产品。目前对于番茄灰霉病的微生物防治研究多数处于实验室和温室阶段，田间应用的极少，多数菌剂在田间应用过程中防效不稳，这是制约微生物菌剂开发应用的一个瓶颈。此外，多数研究只是针对某一种病害，具有广谱抗性的菌株很少。本实验室在土壤中分离出一株新的粉红粘帚菌（WY-1），初步研究表明，该菌对番茄灰霉病、叶霉病、枯萎病、黄萎病和绵疫病等病原菌均有抑制作用（已获专利，专利号ZL2009 1 0072862.4）该菌株是可通过多种机制共同作用抑制数种植物病原菌的生防菌，能有效的防治番茄、辣椒等多种作物的灰霉病、叶霉病、枯萎病、黄萎病和绵疫病等，同时具有较好的促生作用，具有一菌多效的特点。其作用机制包括竞争、重寄生、溶菌、拮抗和诱导抗性等。由于该生物制剂是一种广谱抗性的生防菌剂，对农业生产具有重要的社会意义。这种以防治番茄灰霉病为主的广谱性生防菌剂，可以有效的控制保护地生产病害的发生，在满足菜篮子需求的基础上，更保证了有机蔬菜的安全生产。

葡萄糖二酸是一种重要的化合物，在医疗和工业中有着广泛的应用。目前生产葡萄糖二酸的方法主要以化学法-葡萄糖化学氧化法为主，但该方法具有选择性低、成本高、得率低、要高温及产生大量氧化反应副产物不利于后续葡萄糖二酸的分离等局限性。目前生物法合成葡萄糖二酸主要是在大肠杆菌中进行的，但在大肠杆菌中异源合成葡萄糖二酸被许多因素限制。酿酒酵母因具有耐酸能力强、耐低温、可低 pH 发酵、没有噬菌体感染、适合大规模发酵、易分离和高抗逆性等特点，已被广泛用于产有机酸的研究，因此酿酒酵母比大肠杆菌更适合葡萄糖二酸的生产并具有更高的工业应用价值。利用酿酒酵母合成葡糖二酸具有很好的应用前景。 创新要点 1) 以酿酒酵母 BY4741 为出发菌株，将拟南芥的肌醇加氧酶 MIOX4 和丁香假单胞菌的 UDH 基因在 delta 重复序位点高效表达，敲除转录抑制因子OPI1 获得工程菌 Bga-3，该菌株在分批补料发酵条件下能够产 6 g/L 的葡萄糖二酸，为目前报道的最高值； 2) 通过提高工程菌的转运胞外肌醇的能力和工程菌自身合成肌醇的能力，解决提高葡萄糖二酸产量的关键问题； 3) 进一步协调肌醇用于细胞自身代谢活动和葡萄糖二酸合成之间的分配关系，并通过提高葡萄糖二酸合成途径效率和发酵优化，提高肌醇利用率和葡萄糖二酸合成的产量。 

机体内无机元素的代谢紊乱是糖尿病发病原因之一，因为胰岛素抵抗而形成大量的Ⅱ型糖尿病。研究证明，铬和钒元素可以提高靶组织对胰岛素的敏感性因此补铬补钒是提高胰岛素利用率，降低胰岛素抵抗的有效途径之一，同时可以缓解由于胰岛素抵抗而引起的众多糖尿病并发症。以酵母菌为载体提供的有机铬和有机钒，有利于人和动物体的吸收利用，减少应激性，而且在加工和储存中更为稳定。因此是安全高效的铬钒元素补充形式。本项目提供铬钒酵母的生产和铬钒酵母相关食品饮料的制造技术。

可以量产/n针对当前工业发展对脂肪酶的大量需求与脂肪酶实际表达水平较低的技术瓶颈，突破了脂肪酶超高效表达技术关键，建立了真菌脂肪酶高效表达技术平台，构建的解酯耶氏酵母脂肪酶Lip2基因工程菌10L发酵，酶活力可达6,5000 U/ml以上，比国际报道的最高值提高4倍以上，具有极强的国际竞争力。产品可用于油脂水解、转酯、食品加工、烘焙、生物柴油制备、饲料添加剂、再生纸脱墨等广泛用途。建设其发酵生产线预计需要800-1000万元，经济效益可观。解酯耶氏酵母脂肪酶Lip2可用于油脂水解、转酯、食品加工、烘

成果与项目的背景及主要用途： 蚯蚓又称地龙，是以土壤中的动植物碎屑为食，经常在地下钻洞，把土壤翻 得疏松，使水分和肥料易于进入土壤而提高土壤的肥力，有利于植物的生长；据 测定，蚯蚓的蛋白质含量约占干重的 53.5%-65.1%，脂肪含量约为 4.4%-17.38%， 碳水化合物约为 11%-17.4%，灰分 7.8%-23%。蚯蚓体内还含有丰富的维生素 D （约占鲜体重的 0.04%-0.073%），以及钙和磷（约占鲜体重的 0.24%-0.188%） 等矿物质元素，所以蚯蚓可以作为家禽的饲料，是鸡鸭喜好的“肉类”食物；蚯蚓 体内含有地龙素，地龙解毒素，黄嘌呤，抗组织胺和维生素 B 等多种药用成分， 可作为很好的药用材料；此外，蚯蚓还在淡水钓鱼中适应面广，各种水域，鱼类， 212天津大学科技成果选编 气候都较适宜的钓饵。目前养殖蚯蚓，一般以牛粪，猪粪等动物粪便及稻草，沼 气和生活垃圾等为饲料，但这些资源或者数量少或者难以收集。 近年来，随着食用菌需求量的不断增加，以农作物秸秆和棉籽壳为培养基料 栽培生产食用菌技术发展迅速，并逐步形成规模化和产业化。而栽培各种食用菌 类后剩下的底料-菌糠，数量也大增。据测定，收菌后的菌糠，粗纤维降解 50%， 木质素降解 20%，而粗蛋白含量由原来的 2%提高到 6%-7%，脂肪含量增加 1-5 倍，而且易于粉碎，气味芳香，适口性好。此外，菌糠中还含有丰富的氨基酸， 多糖及铁钙锌镁等微量元素，以及一些代谢产物如微凉酚性物，少量生物碱，黄 酮，还含有肌酸多肽植物甾醇及三萜皂苷等化学物质。丢弃不仅浪费资源，而且 会造成环境污染。因此，菌糠是农业生产中很好的肥料原料，应充分加以利用。 技术原理与工艺流程简介： 1 对菌糠的前处理：将食用菌的废弃培养基菌糠粉碎，喷水搅拌，使其充分 湿润，且均匀，装入发酵罐内。 2 加入 40-50℃水使菌糠的含水量在 50%-60%，优选 55%，再用 80-85℃的 热空气灭菌 16-20 小时，优选 18 小时，降温至 30-40℃。 3 加入至少含有 1*108 个菌/克的菌粉，所述菌粉加入质量为菌糠干重的 1.0%-2.5%，所述菌粉为乳酸菌、芽孢杆菌和粉状毕赤酵母菌株至少一种。通入 30-40℃的空气，通空气量为 0.2-0.3L/min*kg 菌糠干重，通空气 24-36 小时，然 后密闭发酵 10-15 天，得到发酵产物，将所述发酵产物移除发酵罐，晾晒 1-2 天。 4 用草木灰和石灰粉调节 pH 为 6.0-7.0，既制成一种菌糠混合发酵制备的蚯 蚓饵料。 5 采取室内养殖蚯蚓，将制备的蚯蚓饵料均匀铺在 100*30*30cm 的木盆里， 厚度 10cm，铺好后，撒上适量的水，饵料的湿度保持在 50%-70%之间。将蚯蚓 均匀撒上，每平方米投放蚯蚓 500g，温度保持在 15-25℃。蚯蚓投放一天，观察 无异常反应，19 天可扩群一倍。 应用前景分析及效益预测： 213天津大学科技成果选编 本项目克服了现有蚯蚓养殖培养料资源缺乏和菌糠污染环境的不足，采用菌 糠混合发酵制备蚯蚓饵料为菌糠的综合利用及生产高附加值产品（蚯蚓）提供了 一条有效解决途径。 技术水平及专利与获奖情况： 已获得相关授权专利 应用领域：蚯蚓养殖企业，食用菌生产企业