9新发现的小型基因编辑工具SauriCas9兼具活性和编辑范围优势）

01.成果简介 CRISPR/Cas9是细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统。其工作原理是crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。经过研究，通过人工设计tracrRNA/crRNA，改造形成具有引导作用的sgRNA，可以引导Cas9蛋白在多种细胞的特定基因组位点上进行切割、修饰，并最终实现基因突变、插入或缺失。因此，CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用于基因编辑技术领域。 近年来，CRISPR/Cas9基因编辑系统在真核生物和原核生物中得到了广泛的应用。在大肠杆菌等革兰氏阴性菌中，用一个载体表达cas9基因，同时由于革兰氏阴性菌重组效率低，需要在这个载体上表达λ-RED重组酶；在另一个载体中表达sgRNA和用于同源重组的同源臂序列。两个载体都转入大肠杆菌中时，sgRNA介导Cas9蛋白切割基因组上特定序列，形成双链断裂，刺激同源重组的发生，从而实现基因编辑。 本项成果构建了适用于盐单胞菌的基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统。该系统由两个载体组成：第一个载体表达Cas9基因，且不需要表达λ-RED重组酶，实际操作中不再需要诱导λ-RED重组酶的表达，简化了步骤流程；第二个载体表达sgRNA，并含有用于同源重组的同源臂序列。从而实现了基因编辑。本项成果的技术优势包括： （1）基因编辑时间由原有的20余天缩短到7-8天； （2）N个基因编辑时间由原有的N个月缩短到3+5N天； （3）无需表达λ-RED重组酶。                        图1 盐单胞菌TD01进行基因编辑的流程示意图02.应用前景 本项成果可作为CRISPR/Cas9基因编辑系统的载体，广泛应用于基因编辑领域。03.知识产权 本项成果已申请1项发明专利。04.团队介绍 本项目为多团队合作项目，其中一个团队的负责人为清华大学教授，博士生导师，长江学者特聘教授，国家杰出青年基金获得者。主要研究方向为合成生物学、微生物代谢工程、生物材料、工业生物技术。已发表国内外高水平学术论文数十篇，申请专利70余项。05.合作方式 投融资。06.联系方式邮箱：zhangxinrui@tsinghua.edu.cn

本发明属于医药及生物工程领域，涉及一种可用于艾滋病基因治疗的 CRISPR/Cas9 重组慢病毒载体 及其慢病毒，该重组慢病毒载体由慢病毒载体 lentiCRISPR 用 BsmBI 酶切后，连入带 BsmBI 粘性末端 的 CXCR4 特异靶序列重组而得，获得的 CRISPR/Cas9 重组慢病毒载体能够在艾滋病毒辅助受体 CXCR4 的 4&nbs

利用Cas12i和Cas12j在水稻、玉米、大豆、拟南芥和猪等农业生物中验证了基因编辑的靶向剪切活性，达到产业应用的基本要求，为我国基因编辑产业化安全提供了重要保障。 一、项目分类 关键核心技术突破 二、成果简介 基因编辑技术的核心是底盘核酸酶（Cas9、Cas12a、Cas12b），核酸酶的原始核心专利被美国等少数国家所垄断。这些底盘核酸酶的多个核心专利已经在包括中国在内的许多国家获得授权。因此，我国农业生物基因编辑技术在产业化方面有受制于人的风险，必须研发出具有我国自主知识产权的核酸酶，打破国际专利垄断。中国农业大学国家玉米改良中心积极开展具有自主知识产权的新型底盘核酸酶发掘。2017年以来，研发团队从微生物宏基因组中发掘了一系列核酸酶，申报了14项国家发明专利。其中，Cas12i（专利号ZL201980014560.3）和Cas12j（专利号ZL 201980014005.0）两个基因编辑核酸酶已于2021年获得中国及中国香港地区的发明专利授权，并向美国、日本、欧盟等14个国家或地区提交专利申请。已经利用Cas12i和Cas12j在水稻、玉米、大豆、拟南芥和猪等农业生物中验证了基因编辑的靶向剪切活性，达到产业应用的基本要求，为我国基因编辑产业化安全提供了重要保障。目前，两个专利已经以排他性的方式许可给山东舜丰生物科技有限公司。

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