抗生素的发现是20世纪医学史上最辉煌的成就之一。然而，随着抗生素大量和无序使用，抗生素耐药问题则已成为21世纪人类不得不面对的严峻挑战。抗生素耐药问题不仅是困扰临床的一大难题，“超级耐药细菌”的不断出现更是引起公众的极大恐慌，成为全球普遍关注的公共生物安全问题。从遗传学角度，耐药性的产生是细菌为应对环境变化，尤其是抗生素选择压力下进化的产物。在进化历程中，抗生素耐药基因的每个核苷酸位点都可能发生突变，有些突变使细菌对抗生素更敏感，有些会导致更耐药。在抗生素选择压力下，更耐药的突变类型会更容易被筛选出来，并引起逐步扩散和传播。
2022年4月29日，中山大学中山医学院陈小舒教授、杨建荣教授和田国宝教授合作研究团队在Molecular Biology and Evolution在线发表题为“Prediction of Antibiotic Resistance Evolution by Growth Measurement of All Proximal Mutants of Beta-Lactamase”的研究论文。该工作以临床广泛流行的超广谱β-内酰胺酶耐药基因blaCTX-M为研究模型，构建了包含blaCTX-M所有单点突变基因型的大肠杆菌克隆文库，结合高通量测序和神经网络模型实现了对耐药基因进化的溯源和前瞻性预测。
研究团队利用混杂引物、以Fusion PCR的方法在耐药基因中引入突变，构建包含所有单碱基突变的等位基因库，同时每个基因型均带有随机的条形码。为了确保突变基因型在每个细胞中拷贝数一致，作者建立了一套高效的整合系统，将突变基因型整合到大肠杆菌MG1655的attHK022位点，最终获得了等位基因突变体库，并通过三代测序技术获得基因型与条形码的对应关系。结合药物筛选和二代测序技术，测定每个基因型在不同药物浓度下的相对生长值（Relative growth），并绘制了相应的适应度景观（Fitness landscape）。有意思的是，部分位点，如P167、L169、E166，发生突变将显著提高大肠杆菌的相对生长值和MIC值，而这些突变体的主要富集在超广谱β-内酰胺酶CTX-M的活性中心（图1）。
图1. 抗生素耐药基因进化适应度景观的建立
研究团队进一步以适应度景观为基础，分别建立了前瞻性预测模型（PEARP）和回顾性溯源模型（PEARR）。PEARP模型可用于预测新的突变基因型是否耐药，其AUC为0.928。模型预测为耐药的基因型（包括单点、双点、三点、四点突变基因型）显著富集于临床分离到的基因型。PEARR模型可用于回顾性预测耐药基因的进化轨迹，且其预测的进化轨迹在SSWM（Strong-Selection-Weak-Mutation）模型下与独立的药敏实验的结果相符（图2）。
图2：抗生素耐药基因进化的回顾性溯源和前瞻性预测模型
综上所述，研究团队开发的高通量平台可用于精准预测抗生素耐药基因的进化轨迹、辅助抗菌药物设计和指导药物使用，为临床抗生素耐药性防控提供有力支撑。
中山大学中山医学院副研究员冯思源、博士研究生吴卓幸、梁婉菲为论文共同第一作者，陈小舒教授、杨建荣教授和田国宝教授为论文通讯作者。