近日，Plant Biotechnology Journal在线发表了中国农业大学王涛、董江丽团队题为“Construction of genic male sterility system by CRISPR/Cas9 editing from model legume to alfalfa”的研究论文。该研究建立了利用高效基因编辑工具创制苜蓿隐性核不育系及其保持材料的方法。由于隐性核不育系作为杂交母本，对父本没有特定恢复基因的要求，因此该系统能够更为便捷地应用于苜蓿杂交育种制种。
紫花苜蓿 (Medicago sativa) 是全球最重要的豆科饲用作物，是奶业高质量发展的物质基础，享有“牧草之王”的美誉。长期以来，苜蓿产业国际依存度高一直是制约我国畜牧业，特别是乳业发展的短板，我国常年从美国等发达国家进口苜蓿干草150万吨左右，种子85%以上依赖进口，关键问题是育种技术和国际先进水平差距大。解决苜蓿种业“卡脖子问题”，实现苜蓿种业自立自强，种源自主可控，提高我国苜蓿种业竞争力一直是课题组的初心使命。
杂种优势利用是作物遗传改良的重要方式，杂交种创制的核心在于控制授粉，其最佳解决方案就是采用雄性不育系。目前，紫花苜蓿雄性不育系材料非常有限，而且通过正向遗传学尚未克隆到明确的雄性不育基因；同时，与不育系配套的保持系、恢复系材料筛选也非常困难。因此，创建紫花苜蓿系雄性不育系并实现三系配套是技术创新的主要方向。
研究人员首先在近缘模式植物截形苜蓿 (M. truncatula) 中通过反向遗传学策略筛选雄性不育靶标基因并进行功能验证。水稻中OsNP1、HTH1以及玉米中IPE1都属于葡萄糖-甲醇-胆碱 (Glucose-Methanol-Choline, GMC) 氧化还原酶超家族基因，单基因纯合突变能够造成雄性不育表型，且不影响其他性状。但是双子叶植物中尚无该家族成员纯合突变造成雄性不育的报道。研究人员对GMC氧化还原酶家族基因进行系统发育分析和表达模式分析，发现截形苜蓿Medtr5g011020与已报道的雄性不育基因遗传距离较近，在花蕾发育早期雄蕊中特异性高表达，推断Medtr5g011020可能参与苜蓿雄性育性调控，将其命名为MtNP1。利用该课题组前期建立的苜蓿高效基因编辑工具 (Zhu et al., 2021, JXB) 构建突变材料，发现纯合移码突变体Mtnp1具有雄性不育表型。因此MtNP1可作为创制苜蓿雄性不育系的靶标。
图1 截型苜蓿雄性不育基因筛选和功能验证
课题组中利用苜蓿优化的基因编辑工具靶向MsNP1，高效获得紫花苜蓿栽培种突变体材料。所有转基因阳性植株全部发生基因编辑 (16/16)，其中14/16为四等位均发生编辑，2/16为三等位发生编辑而保留一个野生型等位。表型分析发现，全部等位移码突变的Msnp1突变体无成熟花粉粒，而雌性育性正常，是雄性不育系材料；同时，三等位杂合突变体能够产生成熟花粉粒，可作为保持材料与全等位突变体进行姊妹交，后代能够稳定产生不育系基因型，并筛除外源转基因片段。另外，MsNP1靶点基因组区段高度保守，因此该研究设计的雄性不育基因编辑方案适用于不同遗传背景的紫花苜蓿材料，为扩大苜蓿杂交母本背景池提供了重要参考。
图2 紫花苜蓿雄性不育系统创制
经过多年的努力，课题组利用高效基因编辑工具在苜蓿中快速建立隐性核不育系统，通过一次遗传转化同时获得不育系和配套保持材料，并且该系统对恢复系无基因型要求，大大缩短杂交育种周期，为苜蓿杂种优势利用提供了重要的材料资源和方法论基础。据悉，王涛团队在国内外首次创立了简便化、周期短、效率高的苜蓿“快捷三系法”杂种优势利用方法，并已获得2个紫花苜蓿优势组合
中国农业大学生物学院农业生物技术重点实验室王涛教授和董江丽教授为该论文的共同通讯作者，在读博士生叶沁怡为该论文的第一作者。该研究得到山东省农业良种工程 (2019LZGC010)、国家重点研发计划 (2019YFD1002701) 项目资助。