制备蛋白质的方法

一、项目介绍

1. 痛点问题

1963年，Merrifield发展固相合成多肽技术将化学合成生物活性肽变成现实。然而，由于长链多肽在树脂上聚集十分严重，固相合成多肽被认为只能实现50个以下氨基酸残基的高效合成。基于这一问题，芝加哥大学Kent发展出自然化学连接策略，可以将两段及其以上的肽片段高效连接从而实现100个以上残基氨基酸的合成。目前，自然化学连接被认为是应用最为广泛的和最为高效的蛋白质合成方法。自然化学连接法的基本策略是在中性水溶液中硫酯化物多肽片段与N-端半胱氨酸多肽片段可以发生高效的化学选择性的连接反应。然而，自然化学连接技术需要制备多肽硫酯化物。多肽硫酯化物需要采用Boc-SPPS方法进行合成，但是Boc-SPPS需要使用高腐蚀性的危险强酸HF。此外，糖基化、磷酸化及硫酸化等翻译后修饰多肽对HF不稳定。这些问题限制了获取多肽硫酯化物用于自然化学连接合成蛋白。因而，目前的蛋白质的合成方法有待改进。

2. 解决方案

本项成果提供了一种制备蛋白质的方法，其包括通过下列步骤：将C端具有酰肼基团的第一肽与N端为半胱氨酸的第二肽连接：将所述第一肽与所述第二肽在含有NaNO2的溶液中混合并调节pH至酸性，以便将所述第一肽的酰肼基团转化为酰基叠氮基团得到第一反应混合物；向所述第一反应混合物中添加含有巯基基团的还原剂溶液并调节pH至中性，以便所述第一肽的酰基叠氮基团转化为硫酯基团，维持所述中性pH进而所述第一肽的C端硫酯与所述第二肽的N端发生连接反应形成蛋白质。本项成果还提供了多肽硫酯化物的制备方法。

3. 竞争优势分析

C端具有酰肼基团的多肽片段可以利用酰肼树脂作为固相载体直接固相合成获取，避免了现有技术中采用Boc-SPPS方法合成硫酯化物中的弊端。另外，该C端具有酰肼基团的多肽还可以采用生物合成方法合成，具体包含下列步骤：表达含有内含子的蛋白质与C端没有酰肼基团的多肽片段的融合蛋白；以及对所述融合蛋白进行肼解，获得所述C端具有酰肼基团的多肽片段。此外，可通过氧化过程将高度稳定的多肽酰肼转化为可以用于连接的高活性多肽酰基叠氮用于制备合成蛋白。

因此，通过本项成果制备的多肽酰肼稳定，对哌啶、TFA和HF均稳定，可以通过Fmoc或Boc法简单而高效地制备，用于糖蛋白的合成，而且可以利用生物合成的方法合成，能够提高生产效率。除此之外，上述多肽酰肼化-氧化还原连接反应可以重复进行，以实现多条多肽的连接。

4. 市场应用前景

蛋白质的结构和功能关系是当前生物学的前沿热点问题之一，而高纯度的或者特定非天然修饰的蛋白质的获得能大大促进该领域的发展。蛋白质的化学合成与半合成是被认为是获得具有特定结构修饰的目标蛋白的重要途径，因此，发展高效的合成技术是极具学术和商业价值的。

5. 发展规划

目前，基于酰肼多肽的蛋白制备方法已被广泛用于生物医学研究，已通过该制备方法合成了数百种重要蛋白质，如核糖体蛋白S25，泛素化组蛋白H2B，流感嗜血杆菌DNA连接酶，镜像细胞程序性死亡-配体1，镜像免疫检查点蛋白D-TIGIT等，相关研究已在Nature，Nature Chemistry等国际期刊发表相关论文。在未来，本项成果可进一步孵化用于抗体偶联药物、翻译后修饰蛋白药物、镜像蛋白药物等新型蛋白药物的开发与制备。

6. 知识产权情况

已获得一项专利授权。

二、合作需求

本项成果的实现需要微波多肽合成仪器、高效液相色谱及质谱等基础实验设备支撑。应用场景主要涉及蛋白质化学合成领域，如蛋白质功能与结构解析、新型蛋白药物开发与合成等，满足不同阶段科研工作者与企业需求。

三、团队介绍

本项成果完成人为清华大学化学系教授、博士生导师，主要研究方向是蛋白质的化学合成。成果编号：20240072