MiR-29海绵、包含miR-29海绵的核酸构建体及其应用

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抑制miR-29的miR-29海绵、包含该 miR-29海绵的核酸构建体及其在制备用于治疗或预防1型糖尿病的药物中的应用。
    1型糖尿病(T1DM)是一种免疫系统介导胰岛β细胞破坏的自身免疫性疾病。其特征是血糖水平增加(高血糖症) ,这是由于β细胞受损导致的胰岛素分泌不足所造成的。目前，T1DM的传统治疗仍然是胰岛素注射，但是长期的使用并不能满足代谢的需求，并且会导致多种并发症，例如低血糖，视网膜病，心血管疾病等。除此之外胰岛/胰腺移植也由于自身免疫排斥的存在，以及有限的可供使用的供体，导致这种治疗方法不能从根本上解决问题。干细胞疗法能够从细胞和基因水平治疗糖尿病，但是大多处于研究试验阶段，并且对病人存在个体差异和应用局限性。因此，寻找一种有效抑制胰岛β细胞受损，达到治疗T1D的新方法至关重要。
    表观遗传学参与1型糖尿病的发生发展过程，包括DNA甲基化、翻译后组蛋白修饰和microRNAs(miRNAs) ，它们是基因表达的重要调节因子，从而促进了机体对环境因素的生理或病理反应。目前已经发现2500多种人类miRNAs，并且每一种的miRNA又能调控成百上千基因的表达。miRNA的异常表达可以导致胰岛素合成、分泌异常，或产生胰岛素抵抗，还可以影响T、B淋巴细胞的增殖、分化过程，影响免疫细胞信号转导，进而导致糖尿病的发生。许多研究结果显示，miRNA在1型糖尿病发病及病程中都有所改变，可能成为治疗或者预测的潜在标志物。其中miR-29是小鼠胰岛β细胞中表达最丰富的microRNAs之一，由三个密切相关的前体组成：miR-29a、miR-29b和miR-29c。miR-29家族在糖尿病患者肝脏、骨骼肌和脂肪组织中的表达水平增强，与纤维化、糖尿病、恶性肿瘤等多种疾病的发生、发展相关。在病理情况下，研究发现1型糖尿病的儿童血清以及NOD小鼠中miR-29表达是明显增加的。此外，在min6细胞系、小鼠及人的原代胰岛中，使用炎症因子处理后，miR-29的表达量明显增加的。大量数据显示，miR-29与1型糖尿病发生的关系密切，参与了1型糖尿病的发生发展过程。
    非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠是一种广泛用于1型糖尿病研究的啮齿类动物模型，其出现自发性糖尿病的临床特征、病理形态学和免疫学的表现与人类1型糖尿病极为相似。该品系小鼠通常于4～5周龄开始出现胰腺炎，进行性破坏胰岛β细胞，于12周龄时出现明显的糖尿病症状，至30周龄时雌性小鼠累计发病率可达到80％，而雄性小鼠则不到20％。因此，该发明以8-9周龄的雌性NOD鼠为研究对象，便于更好的了解miR-29以及miR-29 sponge在1型糖尿病发病的预防作用。
本发明提供了一种miR-29海绵，并进一步提供了包含该miR-29海绵的 miR-29核酸构建体。该miR-29海绵可吸附体内miR-29a-3p和miR-29b-3p并封闭其功能。
具体地，本发明提供了一种抑制miR-29的miR-29海绵，其核苷酸序列如SEQ No .1所示，具体为：
TAACCGATTTCAGATGGTGCTATATACTAACCGATTTCAGATGGTGCTAACATCAACACTGATTTCAAATGGTGCTATCTTCAAACACTGATTTCAAATGGTGCTATTTTTT。

本发明进一步提出了上述miR-29海绵在制备用于预防和/或治疗1型糖尿病的药物中的应用。研究结果表明，miR-29海绵可以抑制体内miR-29的表达。 本发明进一步提出了一种miR-29核酸构建体，包含表达载体和与所述表达载体有效连接的miR-29海绵。所述“有效连接”是指本发明的miR-29海绵与表达载体的连接使所产生的核酸构建体能在细胞或动物体内转录本发明的miR-29海绵。
优选地，所述表达载体为慢病毒表达质粒，优选地，选用慢病毒表达质粒pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen。
miR-29核酸构建体可以通过在miR-29海绵序列的两端加上与表达载体相配的酶切位点，合成正向序列和反向序列，以与该表达载体有效连接。本发明进一步提出了上述miR-29核酸构建体在制备用于预防和/或治疗1型糖尿病的药物中的应用。
本发明提出的miR-29 sponge通过吸附体内miR-29a-3p和miR-29b-3p阻断其功能，抑制促炎细胞因子的分泌，进而缓解NOD鼠胰岛炎的发生，提高血清胰岛素水平，维持血糖趋于正常水平，最终显著降低NOD鼠1型糖尿病的发病，提高NOD鼠的存活率。