MiR-503簇海绵在制备用于治疗2型糖尿病药物中的应用

本发明属于生物医药技术领域，具体的是涉及一种miR‑503簇海绵在制备用于治疗2型糖尿病药物中的应用。
2型糖尿病的病因多样，除遗传因素如家族遗传外，肥胖、运动缺乏和自然年龄增长被认为是导致糖尿病发生的主要因素。在这些病理因素下，局部组织或全身范围内形成慢性低度炎症，导致内源性胰岛素含量的降低即β细胞功能障碍，以及胰岛素作用减弱即胰岛素抵抗的发生。胰岛素抵抗和β细胞功能障碍共同发挥作用，使患者体内糖脂代谢紊乱并出现多种并发症，是2型糖尿病的典型特征。2型糖尿病的治疗手段包括降糖药物治疗和代谢手术治疗两种方式，减重手术虽然效果显著，但由于创伤较大而仅在极度肥胖的患者中展开，因此药物治疗是2型糖尿病治疗的主要手段。目前有多种药物能分别针对胰岛素抵抗和β细胞功能障碍进行治疗，能够改善胰岛素抵抗的药物包括二甲双胍、噻唑烷二酮类等，促进胰岛素分泌的药物包括GLP‑1受体激动剂、DPP‑4抑制剂；此外，还有抑制葡萄糖吸收的α‑葡萄糖苷酶抑制剂，促进葡萄糖排出的钠‑葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂，以及胰岛素等。胰岛素抵抗和β细胞功能障碍往往同时存在于患者体内，在进行治疗时，通常需要多种药物长期联合使用，这不仅影响患者的生活质量，还能造成低血糖、肥胖或过度消瘦等不良反应。因此，研究并提供一种能够同时改善胰岛素抵抗和β细胞功能障碍的新治疗方法至关重要。
MiRNA是一类进化上高度保守的单链非编码RNA，长约22‑23碱基，在人类中已发现的miRNA有近2500多种。MiRNA经典的作用方式是与其靶基因mRNA的3’‑非翻译区(3’‑UTR)结合，抑制其翻译或促进降解，是基因转录后负性调控的主要执行分子，参与细胞增殖、分化、功能维持等过程。近年来的研究发现，miRNA不仅在胞浆内发挥作用，还能被分泌至细胞外承担细胞间信号交流的功能，其靶基因及作用方式的多样性决定功能的多样性。MiR‑503簇位于X染色体长臂26 .3位点，包括miR‑503和miR‑424(小鼠称miR‑322) ，它们具有相同的种质序列(CGACGA)。研究发现胚胎期胰腺中miR‑503高表达与胰腺发育相关，而出生后胰腺及胰岛中逐渐降低。在成年个体中miR‑503簇仅在肺中高表达，而miR‑503簇在病理条件下重新开放表达能够促进多种疾病的发生，如糖尿病坏疽等。MiRNA海绵(miRNA sponge)是麻省理工大学的Phillip Sharp及其同事开发的一种长期抑制miRNA基因的高效方法。MiRNA海绵是一条mRNA，其3’‑非翻译区(3’‑UTR)包含若干个miRNA靶定位点。更重要的是，这些靶定位点在RISC切割位点有一些错配。这样抑制剂mRNA就不会被降解，而与RISC稳定结合，让它远离天然的mRNA靶点。
本发明提供一种miR‑503簇海绵，其为miR‑503簇的抑制剂，靶向结合内源性miR‑503和miR‑424(小鼠称miR‑322)从而抑制其功能。该miR‑503簇海绵封闭胰岛β细胞中miR‑503簇的表达，进一步将其应用于制备用于治疗2型糖尿病的药物中的应用，以解决2型糖尿病当前治疗方法匮乏以及治疗成本高昂的问题。
具体地，所述miR‑503簇海绵的核苷酸序列如SEQ ID No .1所示，
进一步地，本发明揭示胰岛β细胞内表达增加的miR‑503簇能够损伤β细胞功能，也能促进胰岛素抵抗的发生，发现所述miR‑503簇海绵可以改善老年性糖尿病小鼠糖耐量受损的表型。
具体在应用时，所述miR‑503簇海绵与表达载体有效连接。所述“有效连接”是指本发明的miR‑503簇海绵与表达载体的连接使所产生的核酸构建体能在细胞或动物体内转录本发明的miR‑503簇海绵。
优选地，所述表达载体为8型腺相关病毒载体，优选地，选用胰岛素基因启动子启动序列表达。在一个具体的实施方式中，采用pAAV‑MCS载体。
MiR‑503簇核酸构建体可以通过在miR‑503簇海绵序列的两端加上与表达载体相配的酶切位点，合成正向序列和反向序列，以与该表达载体有效连接。
本发明选择具有明显糖耐量受损的老年小鼠 ，通过尾静脉分别注射M ouse insulin1(MIP1)‑GFP或MIP1‑mmu‑miR‑503‑424‑Sponge病毒载体，观察老年小鼠代谢表型的改变，提供治疗2型糖尿病的新方法。
有益效果：本发明发现敲除miR‑503簇，能够有效缓解高脂喂养造成的胰岛葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能损伤，及外周组抵抗。同时，本发明根据miR‑503簇在β细胞和外周组织中的作用原理，对老年糖尿病小鼠治疗4周后发现，治疗组小鼠糖耐量改善，β细胞GSIS功能改善，治疗7周后外周组织胰岛素敏感性略有恢复。