一种脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷-纳米金颗粒衍生物及其制备方法和应用

技术领域：本发明涉及靶向性多肽，具体涉及一种脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷-纳米金颗粒衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：近年来，由于膳食结构的改变，久坐的工作模式，运动量减少，生活方式逐渐西方化等因素导致能量过度摄入，使肥胖患者的数量在我国迅速增加。肥胖是由于能量摄入大于消耗导致白色脂肪（包括内脏脂肪、皮下脂肪）在体内过度堆积而形成的一种慢性代谢性疾病，它可分为中心性肥胖（也称腹型肥胖，主要表现为内脏脂肪堆积）和单纯性肥胖（主要表现为皮下脂肪堆积）两大类。大量研究发现，白色脂肪增多导致的肥胖是促进胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血脂症、高血压等代谢性疾病发生的主要原因。此外，肥胖除与代谢性疾病有关外，还与多种肿瘤的发生和进展有着紧密的关系。因此，针对肥胖尤其是靶向白色脂肪的干预治疗是预防和治疗肥胖相关疾病的重要措施。目前，对于肥胖症的治疗主要有饮食行为疗法、外科手术和药物治疗。对于大多数肥胖患者来说，减少能量的摄入并增加运动量可以起到减肥效果，但当停止减肥体重会反弹回去，甚至超过了减肥前的体重。而外科手术（如：缩胃术、胃旁路手术、胃束带手术）风险太大。因此，许多肥胖患者把药物治疗作为首选，美国FDA批准了两种可长期应用的减肥药，分别为西布曲明（Sibutramine）和奥利司他（Orlistat）。但长期使用后，前者可引发高血压、失眠等，后者会造成严重的胃肠道副作用，如腹泻、排泄失禁等，导致用药受到限制。因此，在参与代谢综合症相关的器官中，如何使得药物能够仅仅作用于脂肪组织，却对其他脏器和组织不造成影响，从而达到不改变人体免疫系统的基础上能更高效治疗代谢综合症的目的，成为现在肥胖治疗面临的重要问题和研究重点。2004年，著名的科学杂志“Nature Medcine”报道发现一多肽能特异性地和白色脂肪组织血管的内皮细胞受体结合，其氨基酸序列为CKGGRAKDC。中国专利CN102120755A公开了一种棕色脂肪组织靶向性多肽及其应用，公开了多肽可以与具有生物药理活性的物质相连接，能够靶向性运送治疗性药物到达棕色脂肪组织，发挥药理学效应，从而达到靶向治疗的目的，侧重于报道一种棕色脂肪组织靶向性治疗的多肽载体，但该靶向性多肽载体的生物兼容性及所载药物的疗效如何还需要进一步验证。
发明目的：为了解决靶向治疗肥胖的问题，本发明第一方面提供了一种脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷-纳米金颗粒衍生物的制备方法，本发明第二方面提供了一种脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷-纳米金颗粒衍生物，本发明第三方面提供了脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷-纳米金颗粒衍生物在制备治疗肥胖疾病的药物中的应用。
技术方案：本发明所述一种脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷-纳米金颗粒衍生物的制备方法，包括以下步骤：（1）将脂肪组织靶向性多肽C端的半胱氨酸残基的羧基活化生成酰氯，所述脂肪组织靶向性多肽的氨基酸序列为CKGGRAKDC；（2）将毛蕊花苷和氢氧化钠反应得到酚钠；（3）将步骤（1）得到的酰氯和步骤（2）得到的酚钠发生酯化反应生成脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷衍生物；（4）纳米金颗粒进行PEG修饰，将步骤（3）得到的脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷衍生物和PEG修饰的纳米金颗粒混合反应，其中脂肪组织靶向性多肽C端的半胱氨酸残基的巯基和纳米金通过Au-S键连接。步骤（1）中，脂肪组织靶向性多肽的氨基酸序列中各个字母符号所代表的氨基酸残基的定义如下：C为半胱氨酸，K为赖氨酸，G为甘氨酸，R为精氨酸，A为丙氨酸，D为天冬氨酸；所述脂肪组织靶向性多肽的第2位和第7位氨基酸残基的侧链连接有氨基保护基，第5位氨基酸残基（精氨酸）连接有胍基保护基，第8位氨基酸残基连接有羧基保护基，N端氨基酸残基连接有巯基保护基，N端氨基被苄氧甲酰基保护。优选地，所述氨基保护基为9-芴甲氧羰基（Fmoc），所述胍基保护基为金刚烷氧羰基（Adoc），羧基保护基为甲酯，巯基保护基为三苯甲基。步骤（1）中，将多肽CKGGRAKDC用DMSO溶解，然后将多肽溶液加入到三颈瓶内，滴加N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯亚砜，搅拌均匀，70-75℃反应1-2 h，获得酰氯。优选地，10 mg多肽CKGGRAKDC（氨基、侧链羧基、N端巯基已保护）用1 mL DMSO溶解，加入到三颈瓶内，滴加2-5滴的DMF，观察温度计使瓶内温度控制在25 ℃以下，缓慢滴加3-5 mL二氯亚砜，搅拌均匀。随后缓慢升温，于70-75℃反应1-2 h，冷却，获得酰氯，密封备用。步骤（2）中，将毛蕊花苷与氢氧化钠分别用甲醇溶解，将彻底溶解的两种溶液混合，室温反应，生成酚钠。其中，毛蕊花苷的化学结构式见式Ⅰ，毛蕊花苷和氢氧化钠的摩尔比为1:4，即NaOH的量足以和毛蕊花苷的4个酚羟基都发生反应。优选地，将0.1 mol毛蕊花苷和0.4 mol氢氧化钠放入20 mL的甲醇中，充分搅拌均匀至完全溶解。随后，将两种溶液等体积、室温充分混合反应。步骤（3）中，将步骤（2）得到的酚钠溶解在去离子水中，充分搅拌，然后在低温下缓慢均匀滴加步骤（1）获得的酰氯，于10-15 ℃搅拌反应1.5-2 h，反应完全后，清洗、抽滤、压干，获得脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷衍生物。优选地，步骤（1）中所述脂肪组织靶向性多肽和步骤（2）中所述毛蕊花苷的摩尔比为1-5:1。步骤（4）中，所述纳米金颗粒进行PEG修饰的步骤如下：将纳米金颗粒与2 mM SH-mPEG-COOH（分子量5000）溶液于20-25 ℃混合，搅拌孵育12-24 h，随后经离心、洗涤3次将未反应的SH-mPEG-COOH清除，所得沉淀溶于去离子水中备用；所述脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷衍生物和PEG修饰的纳米金颗粒的摩尔比为106:9-5（摩尔比以毛蕊花苷和纳米金的摩尔量确定），反应条件为避光过夜摇匀，摇床转速200-250 rpm，温度20-25 ℃。其中纳米金具有抑制肥胖和提高衍生物的生物兼容性的作用。本发明第二方面提供上述制备方法制备得到的脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷-纳米金颗粒衍生物。本发明第三方面提供所述脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷-纳米金颗粒衍生物在制备治疗肥胖疾病的药物中的应用。优选地，所述药物为注射剂。
有益效果：（1）本发明提供的脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷-纳米金颗粒衍生物，具有良好的生物相容性，可携带药物靶向进入脂肪细胞，大大增强了药物的可利用率，从而显著提高了药物的靶向抗肥胖活性，适用于不同给药方法如静脉注射的靶向作用、腹腔、肌肉和皮下注射的缓控释作用；（2）本发明所用的材料成本低廉、便于获取，制备过程简单快捷，且为常规反应，未破坏药物本身的性质；且本法制备的脂肪组织靶向性多肽-毛蕊花苷-纳米金颗粒衍生物性质稳定，便于保存。