一种多肽纳米泡及其制备方法和应用

技术领域：本发明涉及纳米泡及其应用，具体涉及一种多肽纳米泡及其制备方法和应用。
背景技术：随着人们生活水平的提高，肥胖人群逐年增加。世界卫生组织报道，作为一种慢性代谢性疾病，肥胖已成为全世界引起死亡的五大风险之一，其原因是由于肥胖可引发多种代谢性疾病，如：2型糖尿病、心脑血管疾病及肿瘤等。因此，针对肥胖的干预治疗是预防和治疗肥胖相关疾病的重要措施。至今，对于肥胖的治疗主要有饮食行为疗法、外科手术和药物治疗。对于饮食行为疗法来讲，当停止减肥后，体重会严重反弹，甚至超过了减肥前的体重。而外科手术（如：缩胃术、胃旁路手术、胃束带手术）的风险又太大。所以许多肥胖患者把药物治疗作为首选。目前，美国FDA批准的两种减肥药，分别为西布曲明（Sibutramine）和奥利司他（Orlistat）。但长期使用后存在较大副作用，比如前者可引发高血压、失眠等，后者会造成腹泻、排泄失禁等。因此，在参与代谢综合征相关的器官中，如何使得药物能够仅仅作用于脂肪组织，却对其他脏器和组织不造成影响，从而达到不改变人体免疫系统的基础上能更高效治疗代谢综合征的目的，成为现在肥胖治疗面临的重要问题和研究重点。
2004年，发表在“Nature Medcine”上的一篇报道发现一种多肽能特异性的与白色脂肪组织血管的内皮细胞受体结合，其氨基酸序列为CKGGRAKDC。中国专利2010101599163公开了一种棕色脂肪组织靶向性多肽及其应用，公开了经修饰的多肽可以与具有生物药理活性的物质相连接，能够靶向运送药物到达棕色脂肪组织，发挥药理学效应，从而达到靶向治疗疾病的目的，侧重于报道一种棕色脂肪组织靶向性治疗的多肽载体，但该靶向性多肽载体的载药量及所载药物的种类及治疗肥胖的疗效还有待进一步讨论。为开发具有靶向性治疗代谢疾病（比如恶性肿瘤）的纳米泡药物，有研究者采用人工合成的外源性多肽修饰细胞微泡，但该方法获得的外源性多肽修饰的微泡，其生物兼容性问题有待解决。
发明内容
发明目的：为了解决现有的治疗肥胖的药物靶向性不强且稳定性、生物兼容性差的问题，本发明第一方面提供了一种多肽纳米泡的制备方法，本发明第二方面提供了所述制备方法制备得到的多肽纳米泡，本发明第三方面提供了多肽纳米泡的应用，通过包裹药物（如：核酸类、蛋白类、脂类、糖类、酮类等药物）和不同给药方式（如：静脉注射、皮下或腹腔注射等）靶向治疗肥胖。
技术方案：本发明第一方面提供一种多肽纳米泡的制备方法，包括以下步骤：（1）构建重组质粒，所述重组质粒包括Flag标签、脂肪组织靶向性多肽和微泡标志性膜蛋白CD63的编码基因，Flag标签和脂肪组织靶向性多肽的编码基因按顺序依次连接在微泡标志性膜蛋白CD63编码基因的起始密码子后；其中所述脂肪组织靶向性多肽的氨基酸序列为CKGGRAKDC；（2）将步骤（1）得到的重组质粒通过脂质体转染到分泌纳米泡的细胞中培养收集细胞培养液，经超速离心提取多肽纳米泡。步骤（1）中，所述重组质粒的构建步骤如下：以CD63的cDNA为模板，以CD63-F/CD63-R为引物，经PCR扩增得到Flag-peptide-CD63片段，将Flag-peptide-CD63片段插入出发质粒pIRES2-EGFP的XhoI、EcoRI酶切位点之间得到重组质粒；其中引物CD63-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物CD63-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；其中Flag-peptide-CD63片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。其中CD63的cDNA 的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，包括上游5’非编码序列+CDS +下游3’非编码序列，CDS的核苷酸序列SEQ ID NO:5所示。更优选地，以pOTB7- CD63为模板。其中，CD63-F中含有XhoI酶切位点（CTCGAG）、Flag标签序列（GATTACAAGGATGACGACGATAAG）以及脂肪组织靶向性多肽CKGGRAKDC序列（TGTAAGGGAGGAAGAGCGAAGGATTGT）；CD63-R中含有EcoRI酶切位点（GAATTC）。其中，脂肪组织靶向性多肽的氨基酸序列中各个字母符号所代表的氨基酸残基的定义如下：C为半胱氨酸，K为赖氨酸，G为甘氨酸，R为精氨酸，A为丙氨酸，D为天冬氨酸。步骤（2）中，所述分泌纳米泡的细胞可为未成熟的树状细胞、间充质干细胞及其他细胞（如293T细胞），在此以293T细胞为例说明。重组质粒按照lipofectamine®3000转染试剂（货号：L3000015）说明书导入293T细胞；所述超速离心的步骤如下：细胞培养液经500-1000 g，2-4 ℃，离心10-30 min后取第一次上清，去除细胞沉淀；第一次上清经1500-3000 g，2-4℃，离心20-30 min后取第二次上清，去除一些细胞碎片或残存的细胞器沉淀；第二次上清经2-4℃，100,000-160,000 g，离心1-2 h后得到沉淀，即为多肽纳米泡。本发明第二方面提供所述制备方法制备得到的多肽纳米泡，所述纳米泡为经脂肪组织靶向性多肽修饰的多肽纳米泡。本发明第三方面提供所述的多肽纳米泡作为药物载体在制备治疗肥胖药物中的应用。优选地，所述多肽纳米泡包裹携带治疗肥胖药物，所述治疗肥胖药物为核酸类药物、蛋白类药物、脂类药物、糖类药物或酮类药物。根据携载药物的不同，运用不同方法制备获得多肽纳米泡-药物制剂。更优选地，所述酮类药物为姜黄素。将姜黄素和多肽纳米泡混合，室温培养，随后将混合物经蔗糖密度梯度（蔗糖浓度分别为10 wt.%、20 wt.%、30 wt.%、40 wt.%、50 wt.%、60 wt.%、70 wt.%），200,000 g离心1.5-3 h，收集在40-60 %蔗糖浓度中间的黄色条带，PBS重悬，即为多肽纳米泡-姜黄素制剂，姜黄素是包裹在多肽纳米泡内部的，从而提高姜黄素的稳定性及降低其毒性。
有益效果：（1）本发明提出了一种新的多肽纳米泡，该多肽纳米泡为抗肥胖的药物靶向治疗提供了极大的便利，其具有高效、低毒的优势，所载药物经多肽纳米泡的包裹，使得药物高效的进入靶细胞，大大提高了药物的利用率，从而显著增强了药物的靶向抗肥胖活性，适用于不同给药方法如静脉注射的靶向作用、腹腔、肌肉和皮下注射的缓控释作用。（2）本专利的制备方法过程简单，且未破坏药物本身的性质；制备的多肽纳米泡性质稳定，因制备方法是使用分子克隆、细胞转染的方法将靶向多肽连接到纳米泡膜蛋白上的，这种修饰方法获得的多肽纳米泡结构及性质都非常稳定，不会因外界环境的改变而出现脱靶或降解，和人工合成的多肽化学修饰纳米泡相比，该制备方法优势显著，便于长期保存。