一种多种病原微生物及耐药基因的多重荧光PCR试剂盒包括用于检测目标病原微生物及耐药基因的引物及荧光探针、PCR反应预混液、阳质控品、阴性质控品。利用多个荧光通道分别标记对应检测靶标,通过监控不同荧光通道内荧光信号的变化情况,对不同靶标的扩增情况进行监测,实现对96种病原微生物及耐药基因的检测。本发明多重荧光PCR试剂盒可同时检测多种病原微生物及耐药基因,并且准确性高、特异性强、灵敏度高、快速且结果可靠。