一种冷冻电镜样品制备系统及制备方法

1. 痛点问题

诺贝尔奖获得者Jacques Dubochet等人于1984年发明了冷冻样品制备的滤纸夹置法，至今仍然是冷冻电镜样品制备的主要手段。在这种传统的制样方法中，研究人员难以精确控制样品冰层厚度和大分子颗粒分布，导致冷冻样品的均一性和可重复性较差。研究表明，用滤纸夹置法制备样品时生物大分子会吸附在超薄的液体层的气液界面上，导致生物大分子的颗粒结构损伤、变性或产生优势取向，降低了高分辨率冷冻电镜结构分析的效率和成功率。如何获取可重复的高质量的生物大分子冷冻样品仍然是冷冻电镜技术应用中的一个卡脖子问题。

2. 解决方案

本项成果采用非变性质谱中广泛使用的电喷雾电离（ESI）技术，设计并搭建了一种新型冷冻样品制备装置 ESI-cryoPrep，成功实现了无需滤纸夹吸的冷冻样品制备，并获得了多种生物大分子近原子分辨率的三维结构。研究表明，ESI-cryoPrep可以有效地将生物大分子颗粒完整嵌入无定形态薄层冰中，避免其吸附在空气-水、固体-水界面上，并对该装置制备生物大分子冷冻样品过程中的界面模型进行了机理阐释。

ESI-cryoPrep以“软”电离技术ESI为基础，通过向蛋白溶液施加高电压形成大量带电的蛋白液滴，可以有效地减少蛋白的变性与碎裂。在电场的驱动下，带电液滴飞向电镜载网的过程中伴随着去溶剂化的进行；液滴表面的电荷密度激增至瑞利极限导致库仑裂变形成带电的次级液滴；这一过程循环往复直至液滴最终沉积在电镜载网上；收集到带电液滴的电镜载网被插入液氮冷却的液态乙烷中即可实现对液滴的快速冷冻。该过程完全省却了滤纸的夹吸，避免了滤纸材料对液体和生物大分子的影响。因为液滴表面的小分子离子形成了双电层效应，生物大分子与液体的界面被隔绝开，从而避免了生物大分子吸附到气液或固液界面上，更好地保持了生物大分子的天然结构。

实验室测试仪器（左）及

第一代全自动商业仪器模型（右）