在石油开采、运输和使用中不可避免的会造成对周围环境的污染，尤其是对土壤生态系统的污染日趋严重。对于石油污染土壤生态的修复，国内外已有一些研究，但是，还未见高密度、高活性，能原位大面积使用的降解石油、修复石油污染土壤生态的菌制剂的报道。本发明涉及一种降解石油、修复石油污染土壤生态菌制剂及其制备方法。降解石油、修复石油污染土壤生态的菌制剂是由巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌、粪链球菌和热带假丝酵母经优化组合组成的复合菌群，其中各组分的配比是1～2∶1∶1∶0.5～1。

1 成果简介我国油气田和石油炼化企业普遍存在原油落地污染土壤现象，据统计，我国石油污染土壤面积 500 万公顷。这些土壤不仅不能使农作物很好生长，且代谢产物的毒害作用更是可以通过食物链传递给人类，从而危害人类的健康，极大地影响了我国的农业生产和生态环境。2 应用说明从 2001 年开始，清华大学就一直致力于石油污染土壤的生物修复技术上基础理论和工程实施方面的研究；筛选出几株高效石油烃降解菌株；开发了细菌-真菌协同强化修复技术；研发出一套高效的实际石油污染场地的生物修复工程实施方案，针对不同类型的石油污染土壤的生物治理展开了基础理论研究，并将修复评估体系延伸到微生态角度，建立其标准。本项技术已获得国家发明专利 9 项。并在中原油田实施了 170m2 的污染土壤生物治理小试和11 亩的实际石油污染土壤的中试的工程实施，使得 19 年寸草不生的污染场地恢复种植能力，种植作物为小麦，修复后耕地所种植的小麦能够正常出苗和生长，其产量达到正常耕地种植水平，并经过国家粮油质量监督检验中心和农业部谷物品质监督检验测试中心两家权威检测机构检测，其品质完全符合国家标准。 该项目专家鉴定意见为：“ 该项目开发的技术属原始性创新，已申请国家发明专利 9 项，具有自主知识产权。建议组织好推广应用，深入开展油污土地修复研究”。3 效益分析本项技术可以复耕我国大面积额的石油污染耕地，改善污染耕地的理化性质，从而彻底改变促进我国农业发展，并且解决了污染问题。由于污染造成的耕地污染，石油企业需向当地农民支付每亩每年赔偿金 1300 元。 国际上目前修复成本在 1000~10000$/亩，本项技术的总修复成本在 1500~2050 元/亩， 工程实施开展 3 年内见效，本研究发展的油盐污染土壤修复技术有很好的经济性。图 1 修复前                                                图 2 修复后

针对我国油田区域土壤不同浓度、不同原油物性、不同土壤环境的石油污染，开发物理化学—生物耦合技术以及微生物—植物联合生态修复的分类集成技术，并建立相应的示范工程。在着重开展技术创新与集成的同时，尝试建立油田区污染土壤的修复理论体系、技术规范和评价体系，建设油田区典型石油污染土壤生态修复集成技术的示范工程，同时为在我国大面积开展石油污染土壤修复工作建立一个具有国际先进水平和引领作用的技术研发平台，为我国油田区污染土壤生态功能恢复和环境质量改善提供技术支撑。 1、筛选出的高效石油降解菌与筛

针对我国油田区域土壤不同浓度、不同原油物性、不同土壤环境的石油污染，开发物理化学—生物耦合技术以及微生物—植物联合生态修复的分类集成技术，并建立相应的示范工程。在着重开展技术创新与集成的同时，尝试建立油田区污染土壤的修复理论体系、技术规范和评价体系，建设油田区典型石油污染土壤生态修复集成技术的示范工程，同时为在我国大面积开展石油污染土壤修复工作建立一个具有国际先进水平和引领作用的技术研发平台，为我国油田区污染土壤生态功能恢复和环境质量改善提供技术支撑。

一、项目分类 关键核心技术突破 二、成果简介 近年来随着我国生态文明建设发展和长江黄河大保护等政策的颁布实施，高污染行业逐步关停，产生大量工业污染场地。化工行业退役场地由于其生产工艺复杂、污染程度较高，亟待合理修复，降低风险，以满足土地再利用的要求。然而，这些场地通常具有芳烃、石油烃、卤代物、重金属等复合污染特征，难以通过单一技术一步完成修复。因此，针对工业遗留场地有机-重金属复合重度污染土壤需要快速修复的需求。

本发明涉及一种铜镉复合污染土壤的修复方法，具体如下：在污染土壤中种植牛筋草，并联合施加绿木霉F7或灭活绿木霉F7；所述绿木霉F7的分类命名为Trichoderma virens，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3.17613。绿木霉F7联合牛筋草处理污染土壤，提高了铜镉复合污染土壤的修复效率，微生物与植物之间存在协同促进修复效果的现象；具有良好的生态效应，适用于铜镉复合污染土壤的修复；绿木霉F7发酵液和固体制剂施用方法简单，显著增加牛筋草的生物量，同时可以提高土壤微生物量，改善植物的根际微生态环境。

我国的清洁船舶燃料油（重油型）缺口巨大，每年进口 1000 万吨以上。目前，国内外均采用调和技术生产船舶燃料油，国内大部分产品均为中高硫燃料油（硫含量约为 1.0～3.5%）。传统调和技术技术含量低、生产成本高，且无法实现对劣质原料的有效利用，造成清洁型燃料油产能的严重不足。以欧盟标准的低硫（硫含量<0.1%）清洁船舶燃料油为例，其需求量大且价格昂贵，当前国内无生产企业，全部依靠进口。2020 年，船燃硫含量标准将在全球范围内由现行<3.5%大幅提升至<0.5%。与此同时，国内石油炼化每年产出约 2500 万吨油浆或渣油，大部分作为劣质锅炉燃料低价销售，与清洁船舶燃料油之间存在巨大价差。因此，将劣质重油转变为清洁船舶燃料油具有十分重要的应用价值，潜在的市场价差每年可达 2000 亿人民币以上。 我课题组开发的生物炼化技术可弥补加氢法等在重油脱硫脱氮应用上的缺陷和弊端（如：粘度降低、催化剂中毒等），可重点去除高硫原油、渣油和油浆等劣质油品中的有机硫氮以及重金属等其它有害固杂成分，且保证油品的高粘度。已与多家企业合作完成 800 余次生物脱硫技术测试，脱硫效率可达 30～60%，并初步建立 1～5 吨的中试装置。试制的清洁型 180#和 380#船舶燃料油产品经国家权威检测机构鉴定优于国际标准。该项技术实现突破，可替代传统调和技术，为石化企业、船舶燃料油经销企业提供高品质清洁燃料油的生产和油品升级服务。仅需约 200～300 元/吨成本即可实现劣质油浆转化为优质清洁船舶燃料油（价差大于 1000 元/吨），具显著的经济、社会和环保效益。我课题组基于生物炼化核心技术（8 项专利）已开发以下四项技术，均有较好应用效果，可实现工业化。包括： 1）清洁船舶燃料油制备技术（中试） 2）油浆的生物清洗技术（中试） 3）生物乳化油制备技术（中试） 4）石油污染生物修复剂（产品成熟） 

针对我国大量有机污染场地特别是有机氯污染场地遗留现状和需求，研究开发了超声波-零价铁技术及其相关设备。本技术充分利用了超声波技术的穿透力强、能量集中的优点和零价铁的强还原能力，二者协同作用可以形成类芬顿体系，可在短时间内对有机污染物进行快速处理，实现有机污染场地的快速修复，目前该技术已授权国家发明专利2项。中试设备（下图）单批处理污染土壤量为100kg，处理时间30-60min，对某农药厂场地土壤（主要污染物为有机氯化合物）进行中试处理，土壤中总有机氯污染物的去除率达到65%，各有机氯污染物在土壤

成果重点研究了污染土壤修复功能材料的高效性、配伍性、稳定性和实用性等问题。针对As、Sb污染土壤，以白炭黑为基体，开发了生物型铁基材料，其作用机制主要包括：表面络合、静电吸附、配体交换、氧化还原；针对Pb、Cu、Zn、Cd复合污染土壤，以高岭土/白炭黑为基体，开发了生物型硫化零价铁材料，其作用机制主要包括：离子交换、吸附、沉淀、矿化、表面络合；针对As、Sb、Zn、Ni、Cu复合污染土壤，以赤泥为基体，开发了含磷型修复材料，其作用机制主要包括：离子交换、吸附、表面络合；针对Pb、Cu、Zn、Cd复合污染贫瘠土壤，以硼砂为原料，开发了含硼型修复材料，其作用机制主要包括：离子交换、吸附、表面鳌合；针对多金属（Cd、Pb、Cu、Zn、Sb、As等）复合污染土壤，以白炭黑为载体，以配位、螯合、矿化沉淀、静电吸引等作用机制为导向，通过多种配方的优化组合，已开发出适用不同污染行为的稳定化材料。 目前已完成污染土壤修复示范基地2个。对东安县金江流域锑矿区周边锑、砷污染土壤采用生物性白炭黑材料和硫酸盐还原菌协同稳定化修复后，锑的稳定化率达到53.13%-92.03%，砷的稳定化率达到52.36%-70.9%；对水口山铅锌煤矿区周边多金属复合污染土壤采用含硼型白炭黑材料和红麻联合修复后，土壤中重金属含量分别降低为：Cd，75.46%、Pb，60.54%、Cu，57%、Zn，59.29%、As，44.57%，Sb，21.12%。 成果研制的稳定化材料具有高效的重金属稳定化效果，且能够显著提升农作物产量和抗逆性能；同时白炭黑材料施入土壤可以增加土壤活性硅含量、改善土壤团粒结构、增强土壤通透性、提高土壤水肥涵养能力等。

（一）蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌NJYH63305是团队自行筛选的有益芽孢杆菌，广泛应用于农业、医药、食品保健、饲料等领域。在农业领域，是一种集抑菌、杀虫、促生于一体的环境友好型高效生防制剂，对茶轮斑病菌、黄瓜枯萎病菌、立枯丝核菌、烟草赤星病菌、茶云纹叶枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦纹枯病、尖镰孢菌、镰刀菌、终极腐霉菌等植物病害及小菜蛾具有较强抑制作用。在医药领域，可调节人体肠道微生态平衡，适于治疗急慢性痢疾、肠炎、腹泻、婴幼儿腹泻引起的肠功能紊乱等；在食品保健领域，可作为食品添加剂，长期服用能促进营养物质的消化吸收，减少肠道疾病的发生，提高免疫能力、增强抗病能力。 1、蜡样芽孢杆菌国内外研究进展目前，国内外蜡状芽孢杆菌研究大多处于实验室内研究阶段，其商品化并应用于农业防治的实例较少。国内市场上蜡样芽孢杆菌农用制剂大部分为复配试剂，同时其大规模培养过程中也存在不少问题，如发酵放大过程信息采集困难、制剂有效期不长、产品货架期短等，这些问题的深入研究对解决蜡样芽孢杆菌高密度培养瓶颈、降低蜡样芽孢杆菌生产成本、促进细胞大规模培养领域重大突破具有重要意义。2、本课题组技术优势（1）团队以项目为纽带，建立了蜡样芽孢杆菌在线监控的高密度培养与多阶段发酵集成技术，在1000L发酵罐上蜡样芽孢杆菌活菌数高达800亿个/g, 比初始培养提高了230%，达国际领先水平；（2）筛选的芽孢保护剂，可提高蜡样芽孢杆菌活性，延长半衰期40％以上；（3）协同江苏省农科院及南京农业技术推广站进行绿色防控技术推广，于江苏浦口林大蔬菜基地、江宁区湖熟街道设施蔬菜基地、溧水傅家边茶厂等地建立2800亩示范区，重点试验核心区460亩。推广示范区内，蜡样芽孢杆菌对水稻纹枯病、灰霉病、晚疫病等真菌病害抑制率达51.8％～85.9％，与苏云金芽孢杆菌（Bt）进行增效试验，小菜蛾杀灭率提高29%，降低化学农药使用量50％以上，农药残留量低于国家无公害农产品标准；（4）目前已在国内外重要期刊发表学术论文10余篇，出版专著《高效有益微生态制剂开发与利用——蜡样芽孢杆菌》，申请国家发明专利4项，授权3项，其中3项（ZL200910028025.1、ZL201010579133.0、ZL200910028320.7）在南京新百药业有限公司成功实现转化。（二）凝结芽孢杆菌团队自行筛选获得一株益生凝结芽胞杆菌NJYHHWG 877005，除具有和乳酸菌及双歧杆菌同样的保健功效外，还具有耐酸、耐热、耐盐、容易培养和保存的特点。凝结芽孢杆菌为兼性厌氧菌，进入肠道后会消耗游离氧，有利于厌氧微生物乳酸菌和双歧杆菌的生长，多用于调节肠道内微生态菌群平衡，团队自主知识产权的凝结芽胞杆菌NJYHHWG 877005对甜瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、西瓜炭疽病菌等有很强的防治效果，可进行新型高效生物农药的开发。