该技术可利用人体自身存在的机制进行RNA的单碱基编辑，避免了任何由于表达外源效应蛋白而引起的潜在问题。 新型基因编辑技术（魏文胜团队） 　　LEAPER (Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA)是一类具有我国自主知识产权的新型基因编辑技术，该技术可利用人体自身存在的机制进行RNA的单碱基编辑，避免了任何由于表达外源效应蛋白而引起的潜在问题。LEAPER技术具有高精度、易于递送、长时效、高安全性等多种优点，并在包括遗传性疾病治疗方面展现出了可观的优势及潜能，成功为生命科学基础研究和疾病治疗提供了一种全新的工具。 　　 LEAPER技术原理 　　近年来，以CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑技术在生物医学等诸多领域产生了深远的影响，但存在的一系列问题使该技术在临床治疗应用中遭遇瓶颈。根源之一在于当前的基因编辑体系依赖于外源编辑酶或效应蛋白的表达，从而造成 (1) 蛋白分子量过大使得通过病毒载体进行装载及人体内递送十分困难；(2) 由蛋白过表达引起的DNA/RNA水平的脱靶效应；(3) 由外源蛋白表达引起的机体免疫反应及损伤；(4) 机体内的预存抗体使外源编辑酶或效应蛋白被中和从而导致基因编辑失败等。 　　为解决上述问题，摆脱传统技术依赖于外源蛋白表达的桎梏，2019年魏文胜团队建立了具有我国自主知识产权的名为LEAPER的新型基因编辑技术。与RNAi类似，LEAPER充分利用了细胞中天然存在的机制：仅用一条RNA 就实现了精确高效的RNA单碱基编辑，从而避免了任何由于表达外源效应蛋白而引起的各种潜在问题。研究人员利用LEAPER成功修复了来源于Hurler综合征病人的缺陷细胞，为未来相关疾病的治疗奠定基础。此外，LEAPER还有希望衍生出多种延展型技术，为生物医学等研究提供新型工具。

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins)是目前最常用的基因编辑工具酶，在科研领域被广泛应用，而在临床方面的应用因为其脱靶活性一度停滞不前。它通过guide RNA（gRNA）与靶向DNA序列的配对，从而将Cas9锚定在靶向基因并诱导产生DNA双链断裂（DSB）。在基因编辑诱发的DSB的修复过程中，一定几率会产生基因突变或者外源DNA片段的插入，从而达到基因编辑的目的。在实际应用过程中，一个好的基因编辑酶Cas9需要同时满足高效切割靶位点、低脱靶活性和低染色体异常三个特点。目前在这三个方面，有一部分基于PCR的方法用于估算基因编辑效率，但其结果可靠性有待提高；有一些基于高通量测序的方法可以在体内或者体外检测基因编辑酶的脱靶活性；尚无系统的可定量的测量基因组异常结构的方法。本项目开发了一种新的方法，可以用来同时定量检测Cas9编辑效率和脱靶活性以及编辑引起的染色体异常结构，即primer-extension-mediated sequencing（PEM-seq）。这是对基因编辑和DNA损伤修复等领域都有巨大促进作用的新技术。与此同时，该项目包括了该团队利用PEM-seq筛选出的一个相比于现有Cas9变体具有更低脱靶活性且与野生型Cas9切割效率相当的Cas9变体further enhanced Cas9 (FeCas9)。

研究团队在黄酒、食药用真菌、乳制品发酵工艺以及产品开发方面进行持续研究，其中多项产品已进行产业化生产。乳制品方面，利用所筛选的益生菌，开发出不含有添加剂的无添加酸奶产品、复合功能性发酵乳，并在光明乳业、扬大康源乳业等企业转化应用；利用红曲菌为二级发酵剂，开发新型霉菌成熟软质干酪产品，包括表面成熟奶酪、内部成熟奶酪等，营养丰富、风味柔和，并在徐州市凯舜乳业转化应用。利用原生质体定向选育技术获得多株具有高耐酒精、高发酵活性的黄酒酿酒酵母，以此为基础开发了青稞黄酒、红曲黄酒等产品，并在上海金枫酒业、上海民

开发了一种还原敏感的多功能载体材料，载体的疏水性嵌段包载抗肿瘤光动力药物Ce6，携带NTA基团的嵌段则通过NTA和Cas9蛋白末端His标签之间的特异性结合高效负载Cas9蛋白/sgRNA复合物，然后通过静电组装在外层引入靶向肿瘤组织的iRGD分子。这样的载体结构设计和药物联合输送为实现肿瘤组织特异性的基因编辑和联合治疗提供了可行性。纳米药物靶向输送至肿瘤细胞后，在近红外光的辐照下，Ce6产生的活性氧使溶酶体破裂，使纳米药物从溶酶体中逃逸出来，NTA和载体聚合物之间的二硫键可响应胞质内的谷胱甘肽等还原剂而断裂，从而将Cas9蛋白/sgRNA复合物从载体上释放出来，执行基因编辑功能。在正常的组织中，由于没有近红外光的辐照，Cas9蛋白/sgRNA复合物难以从溶酶体中逃逸，无法执行基因编辑的功能。通过红外光辐照和还原敏感设计实现了肿瘤组织特异的基因编辑。此外，肿瘤细胞在受到Ce6所生成活性氧攻击时，会上调Nrf2（一种活性氧代谢的关键蛋白）的表达，提高肿瘤细胞对活性氧的耐受性。使用靶向Nrf2基因的sgRNA，可以通过联合输送的Cas9蛋白/sgRNA复合物使Nrf2基因失活，提高肿瘤细胞对活性氧的敏感性。总而言之，通过多功能载体联合输送Ce6和Cas9蛋白/sgRNA复合物，一方面实现了肿瘤特异性的基因编辑，另一方面也实现了基因编辑和光动力治疗的联合治疗，协同提高了基因编辑的特异性和治疗效果，为基因编辑技术的发展提供了一个新的方向。

利用基因编辑技术开发系列动物模型，制备第一例家兔自发性高脂血症拟人化疾病动物模型，为心血管疾病治疗以及新一代降血脂药物的研发提供了合适的研究工具，具有广泛的临床转化前景。

01.成果简介 CRISPR/Cas9是细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统。其工作原理是crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。经过研究，通过人工设计tracrRNA/crRNA，改造形成具有引导作用的sgRNA，可以引导Cas9蛋白在多种细胞的特定基因组位点上进行切割、修饰，并最终实现基因突变、插入或缺失。因此，CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用于基因编辑技术领域。 近年来，CRISPR/Cas9基因编辑系统在真核生物和原核生物中得到了广泛的应用。在大肠杆菌等革兰氏阴性菌中，用一个载体表达cas9基因，同时由于革兰氏阴性菌重组效率低，需要在这个载体上表达λ-RED重组酶；在另一个载体中表达sgRNA和用于同源重组的同源臂序列。两个载体都转入大肠杆菌中时，sgRNA介导Cas9蛋白切割基因组上特定序列，形成双链断裂，刺激同源重组的发生，从而实现基因编辑。 本项成果构建了适用于盐单胞菌的基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统。该系统由两个载体组成：第一个载体表达Cas9基因，且不需要表达λ-RED重组酶，实际操作中不再需要诱导λ-RED重组酶的表达，简化了步骤流程；第二个载体表达sgRNA，并含有用于同源重组的同源臂序列。从而实现了基因编辑。本项成果的技术优势包括： （1）基因编辑时间由原有的20余天缩短到7-8天； （2）N个基因编辑时间由原有的N个月缩短到3+5N天； （3）无需表达λ-RED重组酶。                        图1 盐单胞菌TD01进行基因编辑的流程示意图02.应用前景 本项成果可作为CRISPR/Cas9基因编辑系统的载体，广泛应用于基因编辑领域。03.知识产权 本项成果已申请1项发明专利。04.团队介绍 本项目为多团队合作项目，其中一个团队的负责人为清华大学教授，博士生导师，长江学者特聘教授，国家杰出青年基金获得者。主要研究方向为合成生物学、微生物代谢工程、生物材料、工业生物技术。已发表国内外高水平学术论文数十篇，申请专利70余项。05.合作方式 投融资。06.联系方式邮箱：zhangxinrui@tsinghua.edu.cn

研发阶段/n基于基因组定点编辑分子育种新技术及其配套软件。　　成果简介：本成果含有完整的基于CRISPR/Cas系统介导的基因组定点编辑技术，我们对基因组编辑技术切割活性和脱靶效应进行了优化，开发了完整的sgRNA设计，sgRNA表达载体构建，细胞或在体水平基因组打靶和脱靶检测等技术。提高基因组定点打靶效率和降低脱靶风险，为基因组定点编辑技术应用于动植物分子育种打开了新的局面。本成果拥有自主知识产权的基因组编辑技术配套软件，其适用于针对不同物种基因组设计和筛选活性高，特异性强的sgRNA用于动植物分

        我国精神疾病发病率高且增长趋势明显，是我国推进国民大健康战略所面临的巨大挑战。然而当前精神疾病临床诊断缺乏发病机制的依据，主要以临床表型为指标。多数精神疾病的发病原因与人体基因新发突变相关，这种不在父代而仅在子代发生的基因变异对精神疾病的临床诊疗极具重要性。         研发团队建立了从患者新发突变基因组学到转录组、蛋白组学的完整生物组学发病机制临床辅助诊断系统，填补了精神疾病临床诊断的组学机制评价空白，系统自动生成辅助诊断报告和用药风险分析，具有显著的临床应用价值，符合领域发展的国际行业趋势，具有巨大的市场推广潜力。         意向开展成果转化的前提条件：中试放大及产业化工艺开发资金支持

利用Cas12i和Cas12j在水稻、玉米、大豆、拟南芥和猪等农业生物中验证了基因编辑的靶向剪切活性，达到产业应用的基本要求，为我国基因编辑产业化安全提供了重要保障。 一、项目分类 关键核心技术突破 二、成果简介 基因编辑技术的核心是底盘核酸酶（Cas9、Cas12a、Cas12b），核酸酶的原始核心专利被美国等少数国家所垄断。这些底盘核酸酶的多个核心专利已经在包括中国在内的许多国家获得授权。因此，我国农业生物基因编辑技术在产业化方面有受制于人的风险，必须研发出具有我国自主知识产权的核酸酶，打破国际专利垄断。中国农业大学国家玉米改良中心积极开展具有自主知识产权的新型底盘核酸酶发掘。2017年以来，研发团队从微生物宏基因组中发掘了一系列核酸酶，申报了14项国家发明专利。其中，Cas12i（专利号ZL201980014560.3）和Cas12j（专利号ZL 201980014005.0）两个基因编辑核酸酶已于2021年获得中国及中国香港地区的发明专利授权，并向美国、日本、欧盟等14个国家或地区提交专利申请。已经利用Cas12i和Cas12j在水稻、玉米、大豆、拟南芥和猪等农业生物中验证了基因编辑的靶向剪切活性，达到产业应用的基本要求，为我国基因编辑产业化安全提供了重要保障。目前，两个专利已经以排他性的方式许可给山东舜丰生物科技有限公司。