本发明公开了一种构建多位点突变重组表达质粒的高效方法，包括如下步骤：将表达质粒pHAT2用双酶切方法采用两种限制性内切酶NcoI和XhoI酶切产生带有粘性末端5’‑CATG‑3’和5’‑AGCT‑3’线性片段，回收线性化质粒片段备用；PCR引物设计；进行三轮PCR反应得到突变表达载体；进行连接反应；构建突变表达载体。本发明具有突变率高、简单易行的特点。

该发明为家蚕中肠特异启动子P2 ,其在家中肠特异性表达外源蛋白的应用,本发明还涉及家蚕中肠特异 启动子P2的重组载体及其制备方法;本启动子可以特异性地启动下游基因在家蚕中肠高量表达,为硏究和利 用家蚕中肠特异基因，特别是中肠特异高量表达的免疫抗性相关基因提供了有力的工具；同时也能在家蚕中 肠特异高量表达外源基因，具有良好的应用前景。

项目研究背景 ：抗菌肽是在某些诱导条件下，由动植物体内防御系统 产生的对抗外源性病原体致病作用的防御性阳离子多肽类抗菌活性物质。 抗菌肽具有特殊的抗菌机理和广谱高效的抗菌活性。天然抗菌肽获取困 难，主要是采用基因融合的方式进行外源表达。利用生物技术表达、改造 抗菌肽，提高抗菌肽抗菌活性，从而开发出对人体和环境安全无毒的食品 防腐剂和农药产品，还可开发出一类新的抗生素产品。 技术性能 ：本研究在国内首次报道利用大肠杆菌

角蛋白酶是一种特异性蛋白酶类，可降解结构复杂、硬质难溶的角蛋白，具有多种优良的催化特性，在生物加工、绿色制药、废弃生物质处理、生物制革、生态纺织、洗涤剂等实际应用中备受关注，被认为是有着巨大应用潜力和市场前景的新一代蛋白酶类。 本项目从角蛋白酶基因挖掘、高效表达、性能改造及其应用研究等方面开展了一系列工作。课题组目前建立了角蛋白酶资源库，是我国拥有角蛋白酶基因资源产权最多和最具多样性来源的单位；实现了角蛋白酶基因在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌等外源宿主中的克隆及高效表达；在 5L 罐上发酵酶活最高可达10000 U/mL 以上，是目前文献报道的重组角蛋白酶表达最高水平；项目已完成了 1M3 规模中试试验，成本降低 30%以上。在应用方面，本项目成功将角蛋白酶用于生物法制备纳米银粒子 AgNPs，与传统化学法相比，酶法合成的纳米银具有更好的抑菌活性。另外，项目组已首次开发出无胶原活力的高特异性角蛋白酶，具有高角蛋白活力，不会对皮革胶原造成破坏，能保护胶原结构完整性，可开发出不伤及皮肤真皮的洗涤剂产品、药品及化妆品，在生物制革领域也具有极大应用价值，可缓解制革工业中的烂皮现象；同时本研究所开发的角蛋白酶在活性多肽制备中也表现出良好的应用前景。

项目成果/简介:在中国癌症发病率和死亡率呈持续增长趋势，癌症的治疗效果不令人满意。肿瘤靶向药物是癌症治疗的新希望，具有方便、见效快的特点，在临床已表现出较大的优势，能显著改善患者的生存质量和延长患者的生存期，是癌症治疗的首先药物，但靶向药物的应用面临两个主要问题，一是靶向药物的适用性问题，其治疗效果与患者的基因突变类型密切相关，需要通过肿瘤患者的基因突变检测来筛选适用患者；二是靶向药物的耐药问题，一般靶向药物使用几个月即可出现耐药，可能产生新的耐药基因。因此盲目使用靶向药物，可能只对少数患者有效，治疗效果很差，而如果采用基因突变检测来指导靶向药物的个性化治疗，并且在治疗过程中通过对耐药基因的检测了解靶向药物的疗效变化进一步指导靶向用药，则患者的治疗效果可明显改善，同时可避免无效用药，节约社会成本。显然采用靶向药物的个性化治疗方案可使患者受益最多，但受现有技术检测灵敏度和特异性的限制该方案目前还难以实现。由于目前的基因突变检测灵敏度和特异性不够高，大都以肿瘤组织为检测标本，但很多晚期癌症病人不适合手术治疗无法获取组织样本，而细针穿刺等方法取样较痛苦，患者往往难以接受，另外，对于手术患者肿瘤组织样本难以再次取样获得，因此治疗监测过程中会出现无样可取的情况；同时由于检测灵敏度和特异性不够高，现有技术只能进行单一突变检测，不能同时检测多种点突变，由于突变种类较多，临床检测操作繁琐，工作量较大。本项目针对现有检测技术的缺点进行技术创新，采用特殊的TB-ARMS基因突变检测技术使基因突变检测灵敏度和特异性较现有技术提高十倍以上，从而可以血液样品为检测对象，并且可同时检测多种点突变，简化了操作流程，节约了成本。 本项目的目的是开发可以血液和组织样品为检测对象的高灵敏度和特异性的基因突变检测试剂盒，用于临床指导靶向药物的个性化用药，并将其推广应用。应用范围:与目前存在的基因突变检测技术相比，本项目所采用的检测技术具有更广泛的适用性。本项目所采用的技术以病人血液为主要检测标本，可适用于所有肺癌和结直肠癌病人。由于具有高度的灵敏度和特异性，可在高野生型基因背景下进行检测，解除了传统检测技术对病人标本的限制。血液标本采样简单方便，与手术穿刺相比，极大的减轻了病人痛苦，也降低了取样的成本，更容易得到病人的配合。对于继发性耐药的病人而言，使动态实时检测耐药基因称为可能。项目阶段:试验阶段效益分析:与目前存在的基因突变检测技术相比，本项目研究采用的基因突变检测技术具有更高的灵敏度和特异性，灵敏度可达到0.1％，即可在大于103个野生型基因的背景下检测到一个突变基因。本项目研究已在基因突变检测方面积累了一定经验，已完成了对EGFR和K-ras基因检测的实验室研发工作，前期的研究结果显示，采用本项目的技术方法检测EGFR 29种常见突变和K-ras基因8种常见的突变至少可达到0.1%的检测选择性，具有高度的灵敏度和特异性，并且可在同一反应中同时检测8种类型K-ras点突变，这是目前其他ARMS技术所无法达到的。并且采用本项目技术，我们进一步研发了针对肺癌和结直肠癌靶向治疗的EGFR C797S、braf、PIK3CA等突变检测的试剂盒，其中EGFR C797S突变检测试剂盒目前尚无上市产品，C797S为靶向药物治疗过程中产生的突变，可用于靶向药物的耐药监测，以便及时指导病人改变治疗方案。

盐碱地是影响我国农业增产的主要因素之一。近年来植物分子生物学研究表明，植物中存在耐盐（抗盐）基因，如果能将耐盐基因克隆，然后通过遗传转化导入目标植物，可以有效提高目标植物的耐盐性。我们从植物中克隆到了耐盐相关基因，目前的研究工作正在将耐盐基因导入牧草包括苜蓿、百脉根等植物中，已得到大量的遗传转化植株。

在中国癌症发病率和死亡率呈持续增长趋势，癌症的治疗效果不令人满意。肿瘤靶向药物是癌症治疗的新希望，具有方便、见效快的特点，在临床已表现出较大的优势，能显著改善患者的生存质量和延长患者的生存期，是癌症治疗的首先药物，但靶向药物的应用面临两个主要问题，一是靶向药物的适用性问题，其治疗效果与患者的基因突变类型密切相关，需要通过肿瘤患者的基因突变检测来筛选适用患者；二是靶向药物的耐药问题，一般靶向药物使用几个月即可出现耐药，可能产生新的耐药基因。因此盲目使用靶向药物，可能只对少数患者有效，治疗效果很差，而如果采用基因突变检测来指导靶向药物的个性化治疗，并且在治疗过程中通过对耐药基因的检测了解靶向药物的疗效变化进一步指导靶向用药，则患者的治疗效果可明显改善，同时可避免无效用药，节约社会成本。显然采用靶向药物的个性化治疗方案可使患者受益最多，但受现有技术检测灵敏度和特异性的限制该方案目前还难以实现。由于目前的基因突变检测灵敏度和特异性不够高，大都以肿瘤组织为检测标本，但很多晚期癌症病人不适合手术治疗无法获取组织样本，而细针穿刺等方法取样较痛苦，患者往往难以接受，另外，对于手术患者肿瘤组织样本难以再次取样获得，因此治疗监测过程中会出现无样可取的情况；同时由于检测灵敏度和特异性不够高，现有技术只能进行单一突变检测，不能同时检测多种点突变，由于突变种类较多，临床检测操作繁琐，工作量较大。本项目针对现有检测技术的缺点进行技术创新，采用特殊的TB-ARMS基因突变检测技术使基因突变检测灵敏度和特异性较现有技术提高十倍以上，从而可以血液样品为检测对象，并且可同时检测多种点突变，简化了操作流程，节约了成本。 本项目的目的是开发可以血液和组织样品为检测对象的高灵敏度和特异性的基因突变检测试剂盒，用于临床指导靶向药物的个性化用药，并将其推广应用。

本实用公开了一种生物基因提取研磨装置，包括移动件和圆柱形且内部中空的下壳体，下壳体的顶端开口设置，所述移动件包括圆柱形的研磨块和轴线处设有竖直穿孔的圆柱，研磨块的顶端和竖直杆的底端同轴固定，竖直杆的顶端穿过圆柱上的竖直穿孔并延伸至圆柱的上方，圆柱侧边的下部设有外凸螺纹，圆柱的顶端和竖直杆侧边通过连动件连接，下壳体内壁的中上部开设有内陷螺纹，外凸螺纹和内陷螺纹相啮合，研磨块的直径和下壳体内壁的直径相

棉花是我省东部沿海地区最重要的经济作物。转基因棉花的种植面积近年迅速扩大，但是转基因棉籽目前没有得到适当的开发利用。南京工业大学对菜籽棉籽等含油含毒种籽的开发利用研究已经有

通过基因分析以及细胞和斑马鱼模型实验，证实DDX24基因突变导致了该家族患者的内脏血管畸形，并将其命名为多器官静脉淋巴管畸形综合征。后续通过基因诊断和靶向治疗，该家族两名本已病入膏肓的患者目前临床症状得到明显改善。       除以上发现外，依托大科研平台优势以及大学附属医院丰富的临床资源，单鸿教授团队还收集了近500例散发病例进行深入研究并揭示：DDX24突变不仅限于上述家系的患者中，还存在于具有相似畸形血管表型的散发病例中，且检出率高达17%，提示该基因在血管畸形中的重要作用。       血管畸形发病率高，绝大部分发病机制不明，诊断和治疗均存在很大困难；尤其是内脏血管畸形，由于发病部位隐匿，主要依赖MRI、CT等影像检查发现，大多数病人就诊时已发生严重并发症。       血管畸形致病基因DDX24的发现为临床研究提供了新方向，有望成为血管畸形新的诊断依据和治疗靶点。