研究内容 ：本项目采用真空干燥和真空冷冻干燥两步法生产乳酸菌发 酵菌剂。首先在常温下通过真空干燥将细胞的含水量降低到 15-30%，最 后在低温下通过真空冷冻干燥将细胞的含水量降低到 5%以下，可有效防 止细胞内冰晶膨胀、细胞自溶的现象发生，大幅度提高了冷冻干燥过程中 冻干菌剂的存活率，乳酸菌活菌数可达 10cfu/克，超过目前所有市售的乳 酸菌发酵菌剂产品活菌数。 技术优点

1）解决临床细菌学检验周期长的问题，将 5-6 天的检 验周期缩短到 3-6 小时； 2）检测所需血液量少，可减轻患者痛苦； 3）鉴定结果准确，能特异性检测病原体； 4）提高检测过程安全性，不需要进行细菌的扩大培养， 阻止病原菌的扩散，降低院内传播风险； 5）检测成本低； 6）操作流程简单，可进行批量操作； 

本成果从一株高产 L-异亮氨酸的 C. glutamicum 出发，运用反向代谢工程策略对其代谢通路进行理性重排，以期实现 L-苏氨酸高产，特别是近期，通过热诱导丙酮酸羧化酶和苏氨酸外排泵创苏氨酸产率纪录，开发了一种两段式温控发酵苏氨酸的重组大肠杆菌和工艺，发酵罐苏氨酸摩尔转化率达 103.28%。这套复杂中心代谢途径的自我调控维持了生产和生长的平衡。论文用实验室前期构建的一株产苏氨酸的重组大肠杆菌 TWF001 为宿主，首先编辑了涉及副产物有机酸合成、产物降解和转运的基因，并证实这一系列菌种在 37 度升至 42 度情况下的生长情况等同正常 37 度发酵；然后用一套大肠杆菌热敏启动子去转录四环素启动子阻遏蛋白，四环素启动子后的报告基因 37 度表达，42 度不表达。 

类脂 A 是脂多糖分子的疏水基团，大量存在于革兰氏阴性细菌的外膜外层，能通过结合免疫细胞表面的受体 TLR4 来刺激人体免疫系统[50, 51]，因而也是一种很好的免疫系统激活因子。美国 Corexa 公司已经开发出了可用于乙肝病毒疫苗和过敏治疗的疫苗佐剂 MPL。研究表明 MPL 刺激的免疫细胞中 IL-1β 的分泌量 显著降低，使得 MPL 的毒性降低但免疫活性还在。MPL 目前是通过从沙门氏菌的 突变株 Salmonella minnesota RC595 中提取类脂 A，然后用化学方法去除其多余的附加基团而得到。本项目拟利用这些类脂 A 修饰酶，根据类脂 A 分子的合成机理，通过基因工程技术将大肠杆菌中类脂 A 的结构改造成为 MPL，构建能合成 MPL 的大肠杆菌。这种新型的能合成 MPL 的大肠杆菌不仅可以作为宿主菌安全使用于食品和药物的发酵工业生产中，而且可以作为实验室研究中更安全的基因表达载体，最重要的是它可以直接用来生产类脂 A 疫苗佐剂 MPL。

本发明提出单糖-木糖（D-xylose）通过与尿道致病性大肠杆菌的菌毛抗原相结合，抑制尿道致病性大肠杆菌在尿道中的定殖，从而具有预防和治疗尿道致病性大肠杆菌造成的泌尿系统感染的效果。

针对规模化畜禽生产中动物健康、环境卫生和牧场的废气排放造成的社区环境污染，以及动物源人兽共患病的流行和“超级细菌”导致的公共卫生问题，受17个国家、省部和国际合作项目资助，申请人系统地对畜禽场舍内外环境微生物监测，在国内首次阐明密集的畜禽饲养使微生物气溶胶的含量升高、环境质量变坏、并向场舍外扩散；在国际上首次建立了病毒气溶胶传染模型，揭示了禽流感等4种病毒气溶胶的发生、传播及感染机制，认识了疫病气源性传染的过程与规律，丰富了流行病学理论。 从事该领域工作20余年，37名博、硕研究生参与,发表SCI论文35篇，总影响因子116，他人引用536次；检测技术获得2项国家发明专利；一项国家国际合作项目验收为优秀。 （1）确认了畜禽场舍的微生物气溶胶的来源及其传播。即对养鸡猪牛兔等场舍（共126个场）及场舍外不同距离的气载需氧菌、厌氧菌、革兰氏阴性菌及内毒素、真菌及真菌毒素监测，获得了其含量及不同菌群的构成成分；揭示了养殖环境微生物气溶胶向场舍外包括社区居民环境的扩散，在200m之内污染严重。借此，评估了畜禽舍环境卫生和疫病流行风险及对从业人员的传染危害，制定了防控措施；创立了规模化生产“环境性疫病学说”；提出了舍微生物气溶胶既是环境质量指征，又是病原传播感染媒介的学说。 （2）阐明了源于畜禽舍的微生物气溶胶向场舍外扩散，在国际上首次把基因组学技术应用于畜禽舍的微生物气溶胶溯源鉴定。采用PFGE、ERIC和REP-PCR对牧场舍内外环境中分离的指示细菌溯源发现，从牧场舍外下风方向（10-200m）分离的多数微生物来源于舍内空气或粪便（粪便中分离到的与舍内空气中的部分大肠杆菌（鸡舍34.1%、牛栏41.8%）来源相同）。揭示了牧场动物产生的微生物气溶胶不仅在畜禽群内扩散，而且能向场舍外环境传播。首次构建了气源性传染病的传播模式，有公共卫生和流行病学意义。 （3）发现了源于动物体携带毒素基因的病原菌气溶胶的发生与传播。对养鸡猪牛场（共33个）舍内、舍外环境分离的380株气载大肠杆菌携带主要毒素基因的解析发现，鸡舍携带LTa基因的菌株最多为53.85%（63/117）、猪舍携带LTa和STb基因的分别35%和30%、牛舍58.74%大肠杆菌携带1至4种毒素基因。探明了畜禽传染病病原的传播过程。 （4）验证了畜禽饲养中“超级细菌”和泛耐药菌的出现及扩散。应用分子生物技术对养鸡猪牛场舍内、舍外环境分离的426株肠球菌和149株金葡菌耐药基因鉴定，发现了传统的超级细菌：在养鸡场舍内外8株金葡菌为MRSA-耐甲氧西林金葡菌，并携带耐药基因；36株肠球菌携带耐万古霉素vanA或vanB基因。14.55%（62/426）的肠球菌对β-内酰胺酶类抗生素耐药等。揭示了养殖环境耐药菌的产生与传播状况和滥用抗生素导致的危害风险。 （5）确认养殖环境3%-13%气溶胶粒子属于PM2.5。在鸡猪牛舍分别为3.7%、4.9%、13.4%的粒子Dae50＜1µm，这些粒子能够到达肺泡，对动物及饲养员的感染危害更大。该结果为养殖环境饲养卫生管理及卫生标准的制定提供参考，丰富了感染理论。 （6）建立了AIV、NDV等病毒气溶胶的发生、传播及感染模型，阐明其气源性传染的机制与风险。

基于血浆ctDNA靶向深度测序的HER2基因拷贝数变异（SCNA）检测结果与FISH检测结果高度一致，且HER2 SCNA动态监测相比CEA能更好地预测肿瘤退缩或进展，表明基于靶向深度测序的液体活检能够预测曲妥珠单抗的治疗疗效。进一步的研究还发现大多数对曲妥珠单抗原发耐药的患者在疾病进展后展现出更高的HER2 SCNA，而获得性耐药患者HER2 SCNA相对基线明显下降。PIK3CA基因突变在曲妥珠单抗原发耐药患者中显著富集，在部分曲妥珠单抗耐药患者的基线和进展后的血浆ctDNA中可检测到ERBB2/4基因突变。基线血浆中PIK3CA/R1/C3和ERBB2/4基因的突变与更差的PFS显著相关。此外，本研究通过体外和体内的细胞与动物实验研究证实了NF1基因突变可导致曲妥珠单抗耐药，且HER2和MEK/ERK双重阻断可克服NF1突变导致的曲妥珠单抗耐药。       本研究的一系列研究成果表明持续的ctDNA检测可动态监测曲妥珠单抗耐药的发生，揭示潜在的耐药机制，并为下一步治疗方案的调整提供有用的线索。

本项目属于医学应用基础研究领域。以儿童最常见的急性淋巴细胞白血病（acute lymphooblastic leukemia，ALL）和淋巴瘤为研究对象，从临床现象发现，到分子机制研究，全面深入地探讨了糖皮质激素（glucocorticoid, GC）耐药的机制和逆转。GC耐药直接影响了淋巴造血系统肿瘤患者的预后。 该项目在国内率先提出NPM-ALK融合激酶能激活mTOR信号通路（中华血液杂志, 2008）；在国内外率先提出ALK激酶能够通过激活下游的mTOR激酶介导的信号通路诱导淋巴细胞对GC产生耐药性（Leukemia,2008）；在国内首先提出mTOR信号通路的活化是儿童ALL对GC 耐药的主要原因之一，临床上使用mTOR激酶抑制剂能够逆转GC耐药，提示mTOR激酶抑制剂能够成为有效的治疗晚期难治性淋巴系统肿瘤的药物，这对于进一步提高淋巴造血肿瘤的疗效具有极为重要的理论意义和临床应用前景。 本项目在2006年到2011年期间已在国内外学术刊物发表论文9篇，经科技查新，9篇论文总引用频次42次。其中英文论文4篇SCI收录3篇，SCI引用频次36次，其中1篇被引22次，1篇被引14次，中文论文5篇共被引6次。研究结果多次参与国际及全国性学术会议交流，并获得国家自然科学基金面上项目资助1项，四川省应用基础项目资助1项。本项目的研究促进了学科的建设和人才培养，已培养博士、硕士研究生共10余名。

近年来，滥用抗生素产生的耐药性问题日益严重，对人类疾病造成了巨大的威胁。寻找新的可替代抗生素的新药迫在眉睫。抗菌肽（Antimicrobial peptides），是生物体经诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，来源广泛，其分子量小，大约在 3~6 kD 之间，有耐热、 耐酸性强，水溶性好，快速的杀菌能力等特点（Hancock REW，Scott MG. Proc Natl AcadSci USA，2000，97（16）：8856~ 8861）。抗菌肽的抗菌机制不同于普通抗生素，抗菌机制一般包括①

EGFR（表皮生长因子受体）是一种重要的肿瘤靶点，与多种恶性肿瘤的发生和发展有关。西妥昔单抗作为靶向EGFR的单克隆抗体药物在转移性结直肠癌的治疗中具有重要地位，其安全性和有效性已在临床上得到广泛验证，已从三线治疗药物跃居至一线治疗药物。 然而，在用药过程中EGFR胞外区耐药点突变的产生大大限制了西妥昔单抗的疗效，其中一些高频点突变如S492R、G465R可使西妥昔单抗完全失去结合EGFR的能力，患者用药后获益大打折扣。当前临床上仍缺乏有效的抗体新药应对EGFR胞外区点突变介导的西妥昔单抗耐药问题。 因此，探索高效率的抗体药物开发策略用于开发能够有效逆转EGFR胞外区点突变耐药的抗体新药，并应对临床上越发频现的因靶标受体发生点突变而导致的耐药是迫切需要解决的临床问题。 研究团队针对行业痛点开发了计算机辅助设计的抗体快速定向进化技术，发现西妥昔单抗可变区上的一个或两个点突变即可逆转多种EGFR的获得性点突变耐药，西妥昔单抗突变体可完全恢复对耐药点突变受体的结合能力，同时保留原有抗体的其他生物学功能（如CDC、ADCC），从而以最小改动最大限度保留了抗体突变体的成药性。该技术为临床上获得性点突变耐药提供了高效率解决方案，可极大加快抗体新药研发进程。