谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)被广泛用于食品工业生产，是一种安全性很高的工业菌株；具有包括 Sec 和 Tat 分泌途径在内完善的蛋白分泌系统；没有类似于大肠杆菌(E. coli)所带来的内毒素和宿主细胞蛋白污染等问题。这些显著优点使它成为一种有吸引力的外源蛋白表达生产用的底盘细胞。目前国内生物医药领域主要依赖于 E.coli 表达体系生产医药蛋白，原创性外源蛋白表达体系的缺失，在知识产权方面将制约到我国生物医药产业的发展。该项成果有望为我国生物医药产业提供一个具有自主知识 产权的谷氨酸棒杆菌安全高效外源蛋白表达体系。

以加压溶剂提取法为基础，并以高效液相色谱为检测手段，考察了无水乙醇作溶剂时，压力、加压时间对蒜氨酸提取量的影响。并经过离子交换树脂柱以及重结晶提纯得到蒜氨酸纯品。该法无需经过灭酶，避免了高温或者低温的工作环境，在室温下就可以完成蒜氨酸的提取。对比国外普遍采用的超低温真空破碎分离提取、冷冻干燥等工艺，设备投资小，工艺过程简单，便于人员操作，对生产人员知识和技术要求不高，易于实现工业化生产。 

项目研究背景： 该工艺以廉价的 L-Cbz-蛋氨酸为原料， 经内酯化反应 得到关键的中间体 N-Cbz-L- 高丝氨酸内酯， 再与丙基溴反应对羧基进行保 护得到羟基丁酸丙酯衍生物，然后 PBr3 作为卤化试剂发生卤化反应，引 入溴离子离去基，含有离去基的侧链与 N-羟基邻苯二甲酰亚胺发生 N-烷 化反应，引入 NH2-O 健，接着在浓盐酸中脱去保护基并发生水解酞酰亚 胺反应，得到含有

该液体酶稳定剂通用性强，适用于多种酶制剂，并且通用于未经浓缩的酶液、中空纤维超滤浓缩或膜式超滤浓缩的酶液，都可在室温保存三个月至八个月，剩余酶活力在80%。具体技术指标为：1．未经浓缩的液体α-淀粉酶，室温保存9个月，剩余酶活力达80%以上。/line2．中空纤维超滤浓缩的液体α-淀粉酶，室温保存6个月，剩余酶活力达80%以上。/line3．膜式超滤的液体碱性蛋白酶，室温保存8个月，剩余酶活力在80%左右。/line4．未经浓缩的液体糖化酶，室温保存5个月，剩余酶活力接近90%。/line5．经中空纤维超滤浓缩的液体糖化酶，室温保存3个半月，剩余酶活力接近90%。未经浓缩和膜式超滤的酶液添加稳定剂后的液体酶稳定性明显好于经中空纤维超滤浓缩的液体酶。因此膜式超滤较好。实验证明，液体酶添加剂能提高酶的抗变性能力，促进变性酶的复性；不同添加剂之间有协同或拮抗作用，对稳定剂配方的筛选提供了理论依据。/line所用的添加剂价格低廉，来源方便，并具有通用性。主要设备是超滤浓缩装置及包装容器。厂房面积约200平方米。可通过技术转让或技术入股方式进行合作。

可以量产/n针对当前工业发展对脂肪酶的大量需求与脂肪酶实际表达水平较低 的技术瓶颈，突破了脂肪酶超高效表达技术关键，构建的白地霉脂肪酶 基因工程菌 10L 发酵酶活力可达 11,200 U/ml 以上，目前国际报道的白 地霉脂肪酶表达酶活力约 200U/ml，可见本技术之精湛。产品可以用于生 物柴油制备，不饱和脂肪酸富集，油脂水解、转酯、酯化，食品加工、 烘焙等广泛用途。建设其发酵生产线预计需要 800-1000 万元，经济效益 可观。

成果简介： 本研究提供了一种基于ATP再生系统和双功能谷胱甘肽合成酶（GshF）的酶法制备谷胱甘肽的方法。在谷胱甘肽合成过程中，经典的酶法是由谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶两步催化完成的。而 GshF可一步催化谷胱甘肽合成，简化的反应步骤，且该酶反馈抑制作用小，非常适合应用于酶法合成谷胱甘肽。酶法合成谷胱甘肽需要大量消耗ATP，通过引入高

本发明涉及一种绿盲蝽唾液酶中蛋白酶与纤维素酶的体外提取测定方法，利用Paraflim膜，采取膜夹营养法提取绿盲蝽唾液酶，并测定绿盲蝽中蛋白酶与纤维素酶的活性，Paraflim膜法提取绿盲蝽唾液酶利用Paraflim膜、胶卷盒、纱布、橡皮筋、位于两层Paraflim膜间的液体营养介质，利用酶与底物反应的原理，测定绿盲蝽唾液中蛋白酶、纤维素酶的活性。本方法材料易得，操作简单方便，制作成本低，占空间小，可实现绿盲蝽唾液酶的大量、批量提取，并且绿盲蝽可继续回收利用。

通过微生物育种和基因工程手段相结合，获得了一株脯氨酸高产菌株黄色短杆菌。发酵培养 65~68 h， L-脯氨酸产量高达 100 g/L，葡萄糖得率为 45%左右。 关键技术 (1)本研究以玉米浆为氮源，有效的降低了发酵成本； (2)以葡萄糖和味精为原料生产 L-脯氨酸的高转化率发酵，该法绿色、环保、可持续，具有经济竞争力，有很好的产业应用前景。

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一种重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性质已被广泛应用于食品，化妆品，医药，材料等领 域。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是一株谷氨酸 非依赖型 γ-PGA 合成菌。为了提高其 γ-PGA 产量，项目组采用无痕 基因编辑技术对菌株进行了代谢工程改造。包括三部分：模块化代谢 通路改造；蔗糖代谢途径改造；谷氨酸合成途径改造。 B. amyloliquefaciens LL3 是项目组从发酵食品中分离得到，它能 够从蔗糖出发合成 γ-PGA。利用模块化通路改造策略对 γ-PGA 合成 相关的八个代谢通路进行改造包括：γ-PGA 降解相关途径；细胞呼吸 链；胞外蛋白及胞外蛋白酶合成途径；细菌多糖合成途径；次级小分 子代谢产物合成途径；细胞自诱导因子合成途径；谷氨酸合成途径以 及 γ-PGA 合成途径。最终整合获得的最优基因工程菌株 NK-anti-rocG （敲除了 epsA-O 操纵子（负责胞外多糖合成），sac 操纵子（负责果 聚糖合成），lps（脂多糖合成相关），pta（乙酸合成相关），pgdS（γ-PGA 降解酶），cwlO（细胞壁水解酶），luxS（AI-2 合成）以及表达 anti-rocG sRNA（抑制谷氨酸脱氢酶表达））γ-PGA 摇瓶发酵产量从 3.8 g/L 提高到 11.04 g/L，较对照菌株提高了 2.91 倍。γ-PGA 产物纯度也 从 78.6%提高到 95.2%。5-L 罐补料分批发酵实验得到 NK-anti-rocG 菌株产量可达 20.3 g/L。分子量 450,000 Dal，纯度 95%以上。 项目特色： 1. 菌种（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是谷氨酸非依赖型 γ-聚谷 氨酸合成菌株；发酵生产主要原料为蔗糖； 2. 补料分批发酵产量为：20.3 g/L。 3. 授权专利号为：ZL200810053900.7 市场应用前景： γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一种重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性质已被广泛应用于食品，化妆品，医药，材料等领 域。本项目采用谷氨酸非依赖型 γ-聚谷氨酸合成菌做为发酵菌种，以 蔗糖为原料发酵法生产 γ-聚谷氨酸，可产生巨大的经济效益和社会效 益。