琥珀酸是直链饱和二元羧酸，为重要的化工原料，可以合成1，4-丁二酯、四氢呋喃、γ-丁内酯、己二酸等，广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品、塑料和照相材料工业。近年来，由于不断开拓新的应用领域，琥珀酸的需求猛增。利用微生物发酵生产琥珀酸是以可再生资源取代石油生产的一种绿色平台化学技术。同时，发酵法生产琥珀酸过程中需要CO2，将发酵生产琥珀酸与CO2的生物固定过程进行偶合，更有可能将乙醇发酵过程中的CO2或者其他行业的含CO2废气加以利用，开辟了温室气体利用的新途径，从长远利益来讲有利于减缓全球变暖和能源危机。本项目利用代谢工程大肠杆菌进行琥珀酸发酵，通过发酵过程的相关调控，显著提高琥珀酸的合成和对葡萄糖的得率。同时设计了特殊的反应器，提高了二氧化碳的固定效率，实现了有效的琥珀酸生产和二氧化碳固定。主要参数如下：琥珀酸浓度：59g/L；葡萄糖转化率：1.24mol/mol；生产强度：1 g/L/h；本项目的主要创新和技术优势在于：1）利用廉价培养基实现琥珀酸的高效生产，过程简单，产量和生产强度较高，葡萄糖转化效率高；2）固定CO2效果良好，可与乙醇发酵或其它释放CO2的工艺有效偶联，减少CO2排放，并进一步降低成本；3）副产物少，提取方便。

通过微生物育种和基因工程手段相结合，获得了一株脯氨酸高产菌株黄色短杆菌。发酵培养 65~68 h， L-脯氨酸产量高达 100 g/L，葡萄糖得率为 45%左右。 关键技术 (1)本研究以玉米浆为氮源，有效的降低了发酵成本； (2)以葡萄糖和味精为原料生产 L-脯氨酸的高转化率发酵，该法绿色、环保、可持续，具有经济竞争力，有很好的产业应用前景。

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一种重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性质已被广泛应用于食品，化妆品，医药，材料等领 域。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是一株谷氨酸 非依赖型 γ-PGA 合成菌。为了提高其 γ-PGA 产量，项目组采用无痕 基因编辑技术对菌株进行了代谢工程改造。包括三部分：模块化代谢 通路改造；蔗糖代谢途径改造；谷氨酸合成途径改造。 B. amyloliquefaciens LL3 是项目组从发酵食品中分离得到，它能 够从蔗糖出发合成 γ-PGA。利用模块化通路改造策略对 γ-PGA 合成 相关的八个代谢通路进行改造包括：γ-PGA 降解相关途径；细胞呼吸 链；胞外蛋白及胞外蛋白酶合成途径；细菌多糖合成途径；次级小分 子代谢产物合成途径；细胞自诱导因子合成途径；谷氨酸合成途径以 及 γ-PGA 合成途径。最终整合获得的最优基因工程菌株 NK-anti-rocG （敲除了 epsA-O 操纵子（负责胞外多糖合成），sac 操纵子（负责果 聚糖合成），lps（脂多糖合成相关），pta（乙酸合成相关），pgdS（γ-PGA 降解酶），cwlO（细胞壁水解酶），luxS（AI-2 合成）以及表达 anti-rocG sRNA（抑制谷氨酸脱氢酶表达））γ-PGA 摇瓶发酵产量从 3.8 g/L 提高到 11.04 g/L，较对照菌株提高了 2.91 倍。γ-PGA 产物纯度也 从 78.6%提高到 95.2%。5-L 罐补料分批发酵实验得到 NK-anti-rocG 菌株产量可达 20.3 g/L。分子量 450,000 Dal，纯度 95%以上。 项目特色： 1. 菌种（Bacillus amyloliquefaciens）LL3 是谷氨酸非依赖型 γ-聚谷 氨酸合成菌株；发酵生产主要原料为蔗糖； 2. 补料分批发酵产量为：20.3 g/L。 3. 授权专利号为：ZL200810053900.7 市场应用前景： γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一种重要的天然聚合物，由 于其具有良好的性质已被广泛应用于食品，化妆品，医药，材料等领 域。本项目采用谷氨酸非依赖型 γ-聚谷氨酸合成菌做为发酵菌种，以 蔗糖为原料发酵法生产 γ-聚谷氨酸，可产生巨大的经济效益和社会效 益。

成果描述：该产品可用作食品添加剂，特别是面食产品（面包类产品）发酵的中和剂，也可作为痛风病人缓解痛风病痛的药剂，以前是用湿法合成，产率低、时间长、纯度不高，我们现研究用微波“湿一固相”合成方法在10~30分钟内（视反应物量多少）在微波加热条件下快速合成得到所需的产品，产率高、纯度也高、时间短，可大大提高生产率和降低成本。生产中无三废排放属清洁工艺。市场前景分析：1、可应用于面包行业作为发酵产品的中和剂，以代替目前用的小苏打，从而避免用小苏打产生配料变稀的情况，而且可同引入甘氨酸同步制成营养型面包。 2、可中和血液中的尿酸，作为医治痛风病人病痛的药剂。与同类成果相比的优势分析：产率95%以上，纯度95~98%以上。本产品过程中无三废，主要消耗为能量（电能），而且本法比湿法可节约能量20~30%（主要是反应条件不同，合成时间大大缩短，且产率提高）。

L-甲硫氨酸广泛应用于饲料业，是家禽饲料中首选的限制性氨基酸。L-甲硫氨酸是强肝解毒剂、促进发育剂，当缺乏时会引起食欲减退。甲硫氨酸广泛应用于营养补充与畜产饲料，由于甲硫氨酸容易被鸡吸收而转变为鸡肉蛋白，在鸡饲料中添加甲硫氨酸，可少耗饲料，并使鸡肉生长健全。L-甲硫氨酸合成方法主要为化学合成法和微生物发酵法两种。因化学合成法会产生大量有害物质，微生物发酵法生产甲硫氨酸越来越受到关注。本实验室以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，通过代谢工程技术手段进行基因敲除和敲入，以达 到“开源节流”，即增强 L-甲硫氨酸合成路径代谢流，抑制或阻断旁路途径代谢流，最终提高 L-甲硫氨酸产率，目前中间菌株产率已达 21 mmol/L，具有重要的应用前景。 

L-苏氨酸在食品、饲料、医药和化妆品等领域的用量呈长期稳定增长趋势，尤其在饲料添加剂中增长最为迅速。以添加了 L-苏氨酸的低蛋白配方饲料作为家禽日粮，不但可以缓解天然蛋白的匮乏，减少动物氨的排放，还能提高家禽的生产性能。而在医药领域，L-苏氨酸除了用于氨基酸输液之外，随着人类保健意 识的提高，各类氨基酸保健饮品涌现市场，L-苏氨酸是必不可少的配方成分。L-苏氨酸有望取代色氨酸，成为继赖氨酸和甲硫氨酸之后第三大发展最迅速的氨基酸。因此 L-苏氨酸产业迫切需要提高产量，降低成本，以满足市场需求。本实验室以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，通过代谢工程技术手段进行基因敲除和敲入，对关键基因进行了测序、蛋白结构解析及定向改造，以达到“开源节流”，即增强 L-苏氨酸合成路径代谢流，抑制或阻断旁路途径代谢流，最终提高L-苏氨酸产率近 20 倍，具有较好的应用前景。

主要由 D-谷氨酸和 L-谷氨酸通过酰胺键聚合而成。作为一种高分子聚合物，γ-聚谷氨酸具有一些独特的物理、化学和生物学特性如良好的水溶性，超强的吸附性，能彻底被生物降解，无毒无害，可食用等。在农业、食品、医药、化妆品，环保，合成纤维和涂膜等领域具有广泛的应用前景，因此极具开发价值。 微生物絮凝剂是继无机絮凝剂和有机絮凝剂之后出现的一种新型的、可自然降解的水处理剂，具有高效、无毒、无二次污染的特点。微生物絮凝剂是一类由微生物产生并分泌到细胞外具有絮凝活性的代谢产物，一般由多糖、蛋白质、DNA、纤维素、糖蛋白、聚氨基酸等高分子物质构成，分子中含有多种官能团，能使水中胶体悬浮物相互凝聚、沉淀。在传统的絮凝剂中，无机絮凝剂投加量大，效果不佳，还会把大量金属离子带入最终产物中，对环境造成危害；有机合成高分子絮凝剂生物难降解，残留单体有毒，会对环境造成二次污染。而微生物絮凝剂最突出的特点是具有生物降解性，而且高效、无毒、易降解、无二次污染且用途广泛，是环境友好型絮凝剂，因而引起世界各国学者的广泛关注和研究

该产品可用作食品添加剂，特别是面食产品（面包类产品）发酵的中和剂，也可作为痛风病人缓解痛风病痛的药剂，以前是用湿法合成，产率低、时间长、纯度不高，我们现研究用微波“湿一固相”合成方法在10~30 分钟内（视反应物量多少）在微波加热条件下快速合成得到所需的产品，产率高、纯度也高、时间短，可大大提高生产率和降低成本。生产中无三废排放属清洁工艺。

磷脂酶 D 是一种用于磷脂改性的工业化生产用酶，近年来研究较多且效果比较明显的是通过微生物发酵的方法获得磷脂酶 D。磷脂酶 D 主要用于两个方面：一是从卵磷脂出发，通过磷酸基转移反应，制备含量较少的磷脂化合物，如磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）等；二是通过转移反应合成新的磷脂衍生物，用在药物学领域。磷脂酰丝氨酸是磷脂中的一种，天然含量稀少，但它是大脑中主要的酸性磷脂，能控制和调节细胞膜关键蛋白的功能状态，提高脑细胞的活力，改善大脑功能、修复大脑损伤，成为“脑专一性营养物质”。本项目通过菌种筛选获得一株高产磷脂酶 D 的肉桂链霉菌菌株。通过发酵优化，发酵酶活可达到 10U/mL 以上，可用于 PS、PI 的生产。 

本成果从一株高产 L-异亮氨酸的 C. glutamicum 出发，运用反向代谢工程策略对其代谢通路进行理性重排，以期实现 L-苏氨酸高产，特别是近期，通过热诱导丙酮酸羧化酶和苏氨酸外排泵创苏氨酸产率纪录，开发了一种两段式温控发酵苏氨酸的重组大肠杆菌和工艺，发酵罐苏氨酸摩尔转化率达 103.28%。这套复 杂中心代谢途径的自我调控维持了生产和生长的平衡。论文用实验室前期构建的一株产苏氨酸的重组大肠杆菌 TWF001 为宿主，首先编辑了涉及副产物有机酸合成、产物降解和转运的基因，并证实这一系列菌种在 37 度升至 42 度情况下的生长情况等同正常 37 度发酵；然后用一套大肠杆菌热敏启动子去转录四环素启动子阻遏蛋白，四环素启动子后的报告基因 37 度表达，42 度不表达。