鉴定首个高阶环加成酶，拓展了环加成酶的认知 一、项目分类 重大科学前沿创新 二、成果简介 南京大学化学化工学院梁勇教授，生命科学学院谭仁祥教授和戈惠明教授的科研团队，发现了抗幽门螺旋杆菌的潜在药物-汉城霉素并对其生物合成途径进行深入研究。通过多菌株基因组序列比对，对汉城霉素类生物合成基因簇进行了鉴定，利用微生物学，分子生物学、底物化学衍生化、体外酶促反应等手段从该基因簇中鉴定出一个新颖、可催化高阶环加成反应的酶。团队基于蛋白质晶体数据，量子化学计算和蛋白质定点突变技术，对该酶促动力学过程进行了深入解析，最终确定该酶通过“双过渡态”来同时催化产生6+4和4+2环加成产物。该特殊高阶环加成酶的发现，解答了“自然界中是否存在酶催化的高阶环加成反应”，这一持续五十余年的谜题。这类酶的发现将进一步拓展人们对周环反应酶的认识，启发科学家们将来利用和改造周环反应酶来实现有价值的分子转化。 成果于2019年4月以Letter形式发表于Nature。F1000评述该研究“鉴定首个高阶环加成酶，拓展了环加成酶的认知”，诺贝奖得主霍夫曼评述“这是在酶促反应中直接观察到的[6+4]环加成产物的首个例子……，该研究对酶促高阶环加成研究具有深远影响”。

磷脂酶D（PLD,EC 3.1.4.4）是一类广泛存在于各种生物体的酶，具有水解作用和磷酰基转移作用（见图1）。作为一种酶制剂，PLD的转磷脂酰活性尤为重要，被用于制备具有生物活性的稀有磷脂。其中，以大豆磷脂酰胆碱（PC）为底物，PLD酶法制备磷脂酰丝氨酸（PS），受到广泛关注。PS作为脑健康营养补充剂，相继被美国FDA、日本HBM和中国国家卫生计生委所认证，列为新资源食品。相较于提取自牛脑和植物的PS，生物酶法制备的PS，避免了食品安全和植物源含量低的问题。进一步，一些新的结构和功能磷脂，通过PLD转磷脂酰反应被合成出来，例如，磷脂酰鲨肝醇、磷脂酰葡萄糖、心磷脂类似物、磷脂酰酪醇、磷脂酰萜烯和磷脂酰丝氨醇，它们中一些具有抗癌和抗氧化活性。 直到现在，受限于磷脂酶D来源不足和价格高（链霉菌属PLD，≥150 units/mg，6516.9¥/1000 U，Sigma公司），其工业上的广泛应用受到限制。例如，文献报道的PLD最高产量在104-105U·L-1，而制备转化得到每公斤PS，需要2.6×106U的PLD。这一障碍的主要原因是高水平表达的PLD对宿主的严重细胞毒性，导致细胞死亡。 历经5年时间，从上游到下游整体设计，我们解决了毒性蛋白（磷脂酶D，PLD）异源表达难的问题（质粒不稳定、蛋白合成时间短、细胞生长抑制和裂解），PLD生产达到目前世界最高水平106U·L-1(748 mg·L-1)（提高20倍）；同时发展一种简单有效提取重组磷脂酶D的方法（无需破碎、无需添加溶菌酶和有机溶剂、室温进行），PLD生产成本有望降低20倍以上。按照实验室规模的一台5 L发酵罐，年产量可以提供3.5×108U的磷脂酶D，满足100 kg的PS转化需求计算（不计算PLD重复利用率），扩大反应器体积至100-1000 L，PLD产量可满足制备2-20吨PS的需求。

本发明提供一种巴斯德毕赤酵母、产生的耐高温蛋白酶及应用，属于微生物技术领域；本发明通过选育一种可产生耐高温酶的巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)AN‑PK‑9K‑GS115，然后将其进行培养，从发酵液中提取耐高温蛋白酶，将其用于羽毛粉的水解，可以有效水解羽毛粉，将其中蛋白质组分高效降解为小肽成分或者氨基酸成分，从而提高蛋白质的消化率，增加采食量，提高动物健康水平。 （注：本项目发布于2019年）

本发明提供了一种固定化磷脂酶A1在制备磷脂DHA中的应用，具体过程为，六水硝酸钴和2‑甲基咪唑分别溶于无水甲醇得到六水硝酸钴溶液和2‑甲基咪唑溶液，将2‑甲基咪唑溶液滴加至六水硝酸钴溶液中，搅拌反应、静置、干燥，得到ZIF‑67纳米材料，将ZIF‑67纳米材料于磷酸钠缓冲液中混悬，加入磷脂酶A1溶液，调节pH，置于摇床孵育，离心、干燥，获得ZIF‑67纳米材料固定化磷脂酶A1；将游离脂肪酸和大豆卵磷脂组成的底物和固定化磷脂酶A1在有机反应体系中进行催化反应，分离纯化获得磷脂DHA。固定化磷脂酶A1，稳定性好，催化制备磷脂DHA，DHA掺入率高达51.04%。

低分子量肝素(LMWH)是临床上最主要的天然抗凝剂，目前主要是通过动物来源的肝素进行酶降解制得。欧洲药典要求 LMWH 的分子量为 6000~8000，质量控制是生产 LMWH 的重要环节。而肝素酶的活性和利用率直接影响 LMWH 生产成本和产业经济。 本项目组利用融合肝素酶 I (Hep I)与甲壳素之间的亲和作用，实现酶的循环利用，同时融合酶活性和稳定性提高。利用绿色溶剂体系制备形态完好、尺寸均一的甲壳素微球。用固定化酶制备的 LMWH 产品达到欧洲药典要求，实现了分子量可控，生产过程可实时监测。该项目将对 LMWH 产业的绿色和经济生产提供技术支持。目前已发表 SCI 论文 2 篇，并与相关企业开展了合作。 

角蛋白酶是一种特异性蛋白酶类，可降解结构复杂、硬质难溶的角蛋白，具有多种优良的催化特性，在生物加工、绿色制药、废弃生物质处理、生物制革、生态纺织、洗涤剂等实际应用中备受关注，被认为是有着巨大应用潜力和市场前景的新一代蛋白酶类。 本项目从角蛋白酶基因挖掘、高效表达、性能改造及其应用研究等方面开展了一系列工作。课题组目前建立了角蛋白酶资源库，是我国拥有角蛋白酶基因资源产权最多和最具多样性来源的单位；实现了角蛋白酶基因在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌等外源宿主中的克隆及高效表达；在 5L 罐上发酵酶活最高可达10000 U/mL 以上，是目前文献报道的重组角蛋白酶表达最高水平；项目已完成了 1M3 规模中试试验，成本降低 30%以上。在应用方面，本项目成功将角蛋白酶用于生物法制备纳米银粒子 AgNPs，与传统化学法相比，酶法合成的纳米银具有更好的抑菌活性。另外，项目组已首次开发出无胶原活力的高特异性角蛋白酶，具有高角蛋白活力，不会对皮革胶原造成破坏，能保护胶原结构完整性，可开发出不伤及皮肤真皮的洗涤剂产品、药品及化妆品，在生物制革领域也具有极大应用价值，可缓解制革工业中的烂皮现象；同时本研究所开发的角蛋白酶在活性多肽制备中也表现出良好的应用前景。

本发明提供了一种可用于检测潜在指纹的新型银显现试剂及其制备方法。解决了基于银镜反应的传统指纹检测技术制备困难、操作复杂、反应液保质期短等问题。本发明以醋酸银、氨水和甲酸的混合溶液为原材料，利用化学还原反应制备了具有反应活性的银显现试剂。该试剂在空气中加热挥发溶剂后能原位生成银纳米粒子，从而实现潜指纹的显现。此外，该显现试剂还具有制备简单、使用方便、保质期长等优点，能够快速的显现潜指纹，并且在多种材料的表面都表现出了良好的潜指纹显现效果，为识别个人的身份信息提供依据，因此本发明在法庭科学领域中具有广阔的应用前景。

本发明公开了一种检测TNF?α的光电免疫传感器及其制备方法和应用，光基底电极表面依次经GO?PTC?NH2溶液、anti?TNF?α溶液修饰，所述基底电极为玻碳电极或氧化铟锡半导体电极。本发明利用GO?PTC?NH2纳米复合物制备光电免疫生物传感器用于肿瘤标志物检测的方法，与传统的酶联免疫吸附以及PCR等方法相比具有操作简便、技术要求低、反应迅速的特点，所使用的光电探针摒弃了传统金属材料等的光腐蚀等弊端，稳定性较好且负载量大，功能化基团多，便于修饰。

本发明公开了一种交直流混联微网的随机鲁棒耦合型优化调度方法，包括以下步骤：步骤10）获取交直流混联微网的源荷功率预测数据，构造随机不确定性集；步骤20）建立随机鲁棒耦合型优化调度模型的目标函数；步骤30）建立随机鲁棒耦合型优化调度模型的约束条件；步骤40）求解随机鲁棒耦合型优化调度问题：利用列约束生成算法求解随机鲁棒耦合型优化问题，获得交直流混联微网的随机鲁棒协调运行计划。该方法考虑到传统鲁棒优化调度模型保守性强的缺点，将随机优化和鲁棒优化相结合，在保证系统鲁棒性的基础上能够提高交直流混联微网的运行经济性，为制定交直流混联微网的运行方式提供指导和帮助。

该研究发现RNA病毒感染宿主细胞可诱导表达一种新型自噬受体CCDC50，该自噬受体通过识别K63型泛素化修饰的RNA病毒模式识别受体RIG-I/MDA5（RLR）并介导后者的自噬途径依赖的降解，从而抑制病毒感染诱导的I型干扰素的产生，帮助机体恢复到静息状态，避免过度免疫反应造成的组织损伤和自身炎症。我校博士后侯盼盼为论文第一作者，郭德银教授为通讯作者，我校医学院、附属第七医院为第一作者单位。       天然免疫是一种非特异性的宿主抵抗病原微生物入侵的免疫反应,它广泛存在于机体的绝大部分细胞，被认为是机体抵抗病原体感染的第一道防线。随着近几十年的研究，人们对天然免疫系统愈发了解，已经发现并鉴定出天然免疫反应的关键调控因子和信号转导因子，然而某些重要调控因子的结构和功能机制依然不清楚，且这些调控因子的生理和病理作用尚有待于研究。郭德银教授课题组利用CRISPR/Cas9第二代文库在免疫细胞中进行了全基因组水平的大规模无偏差筛选，发现了一系列参与天然免疫反应调控的新型基因。进一步的验证过程中发现CCDC50蛋白在RNA病毒感染下表达量显著增加且其表达模式和RLR的表达模式一致，提示着CCDC50可能参与调控RLR介导的信号通路活性。为了进一步验证该观察结果，该课题组构建了CCDC50条件缺失的小鼠模型，攻毒实验结果证明缺失CCDC50后，病毒感染条件下，I型干扰素表达上调，其下游的ISGs表达水平也随之升高，小鼠清除病毒能力增强，肺部组织损伤和炎性浸润减少，且小鼠存活率增加，从而证明CCDC50在机体水平具有生理学功能。       进一步的机制探究中，该课题组发现CCDC50特异性识别K63泛素化修饰的RLR，并促进激活的RLR的自噬途径依赖的降解，此机制不同于以往了解较多的K48泛素化依赖的降解调控。该过程的发生并不依赖于常见的自噬受体p62， 因p62缺失后，CCDC50依然可以促进RLR的降解，但CCDC50可与p62协同作用。刘迎芳教授团队解析了CCDC50分子LIR结构域和LC3复合体的晶体结构，结构分析证明CCDC50中存在一段非典型的LIR基序，该基序可以结合位于LC3的LDS结合位点，将K63泛素化修饰的RLR拉进自噬小体。有趣的是，紧邻LIR基序，CCDC50有一段MIU基序，该基序可称为反向UIM基序，体外生化实验证实CCDC50-MIU可以结合在LC3的UDS位点，进而证明CCDC50是一种新型自噬货物受体，可以以两段不同的疏水基序结合在LC3的不同位点。这类自噬货物受体是首次在生物体内被发现