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量子相干控制超分辨荧光宽场显微成像

传统的光学显微系统受到阿贝衍射极限原理的限制，无法分辨尺度小于~200nm的事物，为了突破衍射极限，超分辨荧光显微技术应运而生，在生物成像等领域得到广泛应用。根据成像采集过程，超分辨方法主要可分为两类。一种是单分子定位显微方法（SMLM），通过荧光分子的光开关特性，孤立每个发光分子进行单独定位。此类方法具有不受衍射极限限制的特点，可以得到10-40nm的超高分辨率，但由于分子激活漂白的循环步骤使得采集速度和成像时间较慢。另一种是如结构光照明等宽场成像的超分辨显微技术，可以通过获得相邻区域/荧光分子间一定程度的响应差异来实现分辨率的提升。宽场成像的方法具有较高的时间采集效率，但由于同时激发视野内的全部分子，使得其分辨能力往往在100nm以上。目前还缺乏一种方法在理论上可以有效的兼顾宽场成像的时间采集效率和单分子定位方法的空间分辨率，因此亟需提出一种基于宽场成像对荧光分子高效调制的技术方案。超分辨方法其本质都是通过识别单个荧光分子的独立的发射特性获得该分子的空间定位。如果可以对宽场成像中衍射极限以内各个发光分子荧光发射差异实现主动控制，则有可能获得更好的超分辨显微结果。近期，物理学院介观物理国家重点实验室极端光学研究团队提出了基于量子相干控制原理主动调制分子荧光发射而获得超分辨荧光显微的方法（SNAC），在宽场成像下实现了分辨率的提升。课题组在ZnCdS量子点体系下获得衍射极限范围内各个量子点的差异化激发。通过设计多个整形脉冲，单个ZnCdS量子点的荧光差异性会得到增强。课题组通过周期性改变整形脉冲和傅立叶增强提取荧光响应的差异。同时，主动控制的图像采集方案可以有效的抑制系统中不随调制周期变化的泊松随机噪声和CMOS工艺导致的固定噪声，极大的提升了信噪比。接着，利用独立开发的混合周期（Combination-FFT）和多高斯拟合定位算法获得最终的超分辨重建结果。研究模拟了邻近双点荧光发射的超分辨定位，其结果可以很好的分辨出低至50nm的相邻荧光分子。对于密集标记的线性结构，SNAC的分辨能力同样有显著性的提高，获得了30nm左右的径向定位精度。在量子点标记的COS7细胞样品的维管结构区域清晰的观测到了维管的平行取向和姿态排布以及纤维交叉区域的95.3nm的邻近双峰，显示出了比已有多种宽场超分辨方法更好的重建结果。这个研究将脉冲整形作为新的控制维度引入荧光超分辨，并将宽场超分辨成像技术的分辨率提升到了与单分子定位方法接近的50nm的水平。

北京大学 2021-04-11