本发明公开了一种构建多位点突变重组表达质粒的高效方法,包括如下步骤:将表达质粒pHAT2用双酶切方法采用两种限制性内切酶NcoI和XhoI酶切产生带有粘性末端5’‑CATG‑3’和5’‑AGCT‑3’线性片段,回收线性化质粒片段备用;PCR引物设计;进行三轮PCR反应得到突变表达载体;进行连接反应;构建突变表达载体。本发明具有突变率高、简单易行的特点。