Mpa六聚体除了与真核生物蛋白酶体调节颗粒Rpt1-Rpt6蛋白六聚体以及古细菌PAN蛋白六聚体具有一定的结构同源性之外，还具有一些明显不同的结构特征：（1）结核杆菌Mpa具有形成双环的两个串联寡核苷酸/寡糖结合（OB）结构域，而古细菌蛋白酶体相关ATPase调控颗粒（PAN）和真核生物蛋白酶体ATPase调控颗粒复合体（Rpt1-6）每个蛋白亚基都只具有单个OB结构域；（2）Mpa在具有蛋白酶体活化功能的C末端之前具有一个泛素样的β-grasp结构域，而古细菌PAN和真核生物Rpt1-6蛋白复合体并不具有这样的一个β-grasp结构域 由于β-grasp结构域的存在，Mpa六聚体中各个蛋白亚基C末端被埋在结构核心中而没有暴露在蛋白复合体结构的表面，这就影响了C末端的GQYL基序与20S 蛋白酶体复合体的对接，从而阻碍了六聚化的Mpa与七次对称的28聚体的蛋白酶体相互作用。我们通过功能研究进一步解释了为什么单独的Mpa六聚体在体外情况下不能有效结合蛋白酶体核心颗粒并启动蛋白质特异性降解，结合晶体结构域功能研究，我们提出了结核杆菌蛋白酶体ATPase调控颗粒Mpa与20S蛋白酶体复合体这一分子量超过1100KDa蛋白质机器的作用模型

本发明所构建的融合蛋白 EAMM 能在大肠杆菌中稳定大量表 达，经纯化得到纯度较高的蛋白;构建的亚单位疫苗免疫动物能产生 针对结核杆菌特定抗原(ESAT-6、Ag85B、Mtb8.4 和 PPD)的特异 性的细胞免疫和体液免疫应答，具有较强的免疫原性。EAMM 亚单 位疫苗加强免疫后的结核菌载量明显少于 PBS 组和仅 BCG 免疫组， 表明清除结核分枝杆菌的能力较强。从组织切片 HE 染色

本发明所构建的融合蛋白EAMM 能在大肠杆菌中稳定大量表达， 经纯化得到纯度较高的蛋白；构建的亚单位疫苗免疫动物能产生针对结核杆菌特定抗原（ESAT-6、Ag85B、Mtb8.4和PPD）的特异性的细胞 免疫和体液免疫应答，具有较强的免疫原性。

蛋白酶体是细胞用来调控特定蛋白质的浓度和清除错误折叠蛋白质的主要机制，是细胞中最普遍的不可或缺的大型 蛋白复合机器之一，也是迄今为止发现的最大的蛋白降解机器。 蛋白酶体全酶是由盖子 (Lid)和基座(Base)亚复 合体组成的调控颗粒RP(Regulatory Particle)所激活。基座亚复合体在组装过程中最重要的一个步骤是异质六 聚AAA-ATPase环的组装。这个过程至少需要被PAAF1, p28/gankyrin, p27/PSMD9和S5b这四种调控颗粒(RP)组 装伴侣蛋白分子所引导。天然的自由态19S调控复合体的构象存在大量的亚稳定态，并表现出大幅度的局部构象涨 落，使冷冻电子显微镜技术成为解析其结构的唯一手段。利用 冷冻电镜解析人源蛋白酶体全酶的基础上（见PNAS 2016, 113: 12991-12996），利用他们自主开发的基于统计 流行算法的高性能计算软件ROME（见PLoS ONE 2017, 12:e0182130）与优化的冷冻电镜处理方法对p28-RP复合 体细微动态构象进行深度分类，共解析出了1个4.5-? p28绑定的调控颗粒（RP）非AAA的亚复合体，3个近7-? p28 绑定的完整RP结构，1个亚纳米精度下的非p28绑定的完整RP结构以及7个亚纳米精度下的由Rpn1-p28-AAA组成的p28 绑定RP的亚复合体的动态构象。观察到自由态RP调控颗粒中p28-绑定的AAA环并没有组成的闭 环孔状通道，而是自发地在Rpt2-Rpt6和Rpt3-Rpt4界面上形成多个由“开”到“关”的拓扑变构。

已有样品/n本项目筛选获得了一个蛋白酶，并利用该酶建立了制备明胶的新工艺。与传统酸碱法相比，该工艺能够节约淡水50%以上，生产周期从60-100天缩短为5-10天，同时大幅降低酸碱试剂的消耗量，与普通酶法相比，成本降低，产品质量和得率将大幅提高。本技术适用于现有明胶厂的工艺升级替代。总投资额600-1000万元，综合成本降低20%，三废排放降低30%。

本发明公开了一种产角蛋白酶的粘金黄杆菌及其分离方法。所述粘金黄杆菌拉丁名为Chryseobac？terium？L99，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.2295。本发明公开了该菌的形态学特征为：菌体杆状，不产孢子，无运动性，革兰氏染色呈阴性。本发明公开了该菌的全细胞脂肪酸主要成份为：十三甲基十四酸47.59％，二羟基-13-甲基十四酸和(或)Ω-7-顺式-13甲基-十五酸15.72％，三羟基-15-甲基十六酸13.91％，Ω-9-顺式-14甲基棕榈酸9.48％。本发明还公开了该菌的16S核糖体DNA(16S？rDNA)全序列。本发明公开的分离方法包括三个步骤：普通营养培养基富集培养，以角蛋白为唯一碳氮源固体培养基初筛，以角蛋白为唯一碳氮源液体培养基的复筛。该方法快捷有效，所得菌种产酶能力强。

蛋白酶体是细胞中用来调控特定蛋白质的浓度和清除错误折叠蛋白质的主要机制的核心组成部分，是细胞中最普遍的不可或缺的大型全酶超分子复合机器之一，也是迄今为止发现的最大的蛋白降解机器。人源蛋白酶体全酶包含至少64个亚基，由盖子 (Lid)和基座(Base)亚复合体组成的调控颗粒RP(Regulatory Particle)所激活。2016年，该课题组与其合作者在《美国科学院院刊》报道了人源蛋白酶体的基态近原子分辨的冷冻电镜结构，以及三个亚纳米分辨的RP-CP亚复合体亚稳或过渡态的共存结构，并首次发现其中一个亚稳态构象的CP的底物转运通道处于开放状态（见PNAS 2016, 113: 12991-12996）。这一发现被德国马普所Baumeister课题组及其合作者在2017年的一篇《美国科学院院刊》论文中通过酵母蛋白酶体全酶的冷冻电镜亚纳米精度分析进一步证实、引用和比较（见PNAS 2017, 114, 1305-1310）。然而，在这些工作中，CP开放态的全酶结构离近原子分辨还有较大距离，未能充分揭示人源蛋白酶体全酶的激活后的运动行为。毛有东、欧阳颀课题组及其合作者在前期工作的基础上，利用他们自主开发的基于统计流行算法的高性能计算软件ROME（见PLoS ONE 2017, 12:e0182130）与优化的冷冻电镜处理方法，对ATP-γS结合状态下的人源蛋白酶体的全酶冷冻电镜单颗粒数据展开了深入分析，得到了6个共存的动态结构，其中包括3.6埃分辨率的基态结构，3.5埃的开放态CP结构，和三个CP开放态对应的亚稳简并态全酶4.2埃，4.3埃和4.9埃的结构。另外两个中间态结构分辨率为7.0埃和5.8埃。三个CP开放态对应的全酶结构的主要差别在于位于RP的AAA-ATPase激酶马达模块，伴随其不同的构象变化，至少有四个ATP-γS分子稳定结合在不同的AAA-ATPase亚基上，为其在不同核酸结合状态下形成的非稳定动态构象提供了重要证据。该研究首次观察到位于AAA-ATPase激酶马达模块中心的底物转运通道呈现从螺旋到鞍形不同的拓扑结构变化，为进一步分析底物和蛋白酶体全酶的相互作用奠定了重要基础。人源蛋白酶体全酶AAA-ATPase马达模块中心的底物转运通道发生大幅度的拓扑变构

本发明目的是提供一种产低温碱性蛋白酶的菌株，为芽孢杆菌(Bacillus sp.)WFWBac‑1，于2015年4月9日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10703。本发明筛选的菌株用于发酵生产碱性蛋白酶。本发明筛选的菌株性状优良、产蛋白酶活力高；该菌株在以蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源，培养基初始pH 9.0，培养温度25℃，接种量为10％的条件下150rpm振荡培养48h时，所产蛋白酶活性最高能达到995U/mL。所制备的酶用于制备洗衣液或洗洁精。

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、及其应用、大量制备豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。如上所述本发明的发明人首先利用pcr反应从豇豆基因组dna中直接获得cpti基因(cpti基因不含有内含子)，然后优化改造所述cpti序列，改造后的序列在大肠杆菌中的表达量和表达比活性都有显著改进。

项目成果/简介:本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、及其应用、大量制备豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。如上所述本发明的发明人首先利用pcr反应从豇豆基因组dna中直接获得cpti基因(cpti基因不含有内含子)，然后优化改造所述cpti序列，改造后的序列在大肠杆菌中的表达量和表达比活性都有显著改进。