近日，北京市自然科学基金资助的重点研究专题项目“超高分辨冷冻电子显微镜成像方法研究与应用”取得重要进展。
在该项目支持下，北京大学毛有东教授团队于2022年4月27日在国际顶级学术期刊Nature杂志在线发表了题为“USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM”的研究论文，阐明了原子水平人源蛋白酶体动力学调控和构象重编程机制，并在国际上首次展示了人工智能四维重建技术用于大幅提升时间分辨冷冻电镜分析精度。
蛋白酶体功能紊乱与人体多种疾病相关，如癌症、神经退行性疾病和免疫疾病等。蛋白酶体是美国FDA批准的多种治疗癌症的上市小分子药物的直接靶标。
在正常细胞中，蛋白酶体的功能受到多个水平的严格调控。去泛素化酶USP14是最主要的蛋白酶体调控分子，被认为是一个潜力巨大的治疗癌症和神经退行性疾病的重要靶标，其小分子抑制剂曾进入过美国一期临床研究，但围绕USP14功能机制的一系列悬而未决的关键问题极大限制了其靶向药物分子的开发和临床应用。USP14通过结合26S而被激活，然后以毫秒的时间尺度剪切底物上的泛素链。它是如何被蛋白酶体激活并调控蛋白酶体功能的，一直是全球研究机构和生物制药领域期待解决的关键科学问题。
生命分子机器通过高度复杂的非平衡动力学过程和结构变化来实现其特殊功能，这一过程进而受到各种复杂分子间相互作用的精准调控。如何在原子水平直接观察天然态超大分子机器的功能态动力学过程，给现有的原子结构动态分析技术提出了空前挑战。
毛有东教授实验室长期致力于发展基于冷冻电镜的动力学重建方法，围绕蛋白酶体、炎症小体等具有重大临床应用前景的靶点系统的结构功能、动力学机制和靶向调控分子设计深入开展前沿交叉研究。
课题组前期的系列工作揭示了蛋白酶体的原子架构、组装原理和降解泛素化底物的动力学基本规律。
图1. (A) USP14调控下蛋白酶体复合体降解多泛素化底物的原子结构模型之一。(B) 时间分辨率冷冻电镜解析13种中间态的统计分布随蛋白质降解进程的时间演化。（Youdong Mao, CC BY 4.0）
本研究课题进行之初，首先要克服的问题就是“时间分辨”。蛋白酶体降解底物的过程是很快的，时间尺度在毫秒至秒之间。正常条件下，想要通过冷冻电镜技术捕获此过程的中间态结构，是非常困难的。所以，课题组首先要让这个过程慢下来。通过大量的条件摸索，重建反应动力学体系和优化反应条件，包括优化缓冲体系、反应温度等条件，课题组优化出较为可行的实验方案，从而使得时间分辨冷冻电镜技术应用成为可能，最终获得了含时的45,193张USP14-26S复合体降解泛素底物过程中的冷冻电镜透射图样，挑取了3,556,806个USP14-26S-泛素底物复合体的颗粒图像。
接下来面临的极端挑战就是“三维分类”，冷冻电镜捕获的复合体图像需要经过一系列的分类，将它们归为不同的构象类别，才能呈现出蛋白反应的动态过程。USP14结合到26S蛋白酶体后，使得降解底物的动力学过程更加复杂，想要在如此多的异构复合体颗粒图像中，鉴别出降解过程的各个时态的高分辨率非平衡构象，传统的三维分类方法是无法实现的。低精度的三维分类将导致低分辩的三维重建，从而无法获取原子水平的动力学信息，无法对含时的数据赋予自洽的动态变化的物理意义。
课题组结合经过数年自主开发的新型深度学习高精度三维分类和四维重建方法，捕获了USP14-26S复合体降解多泛素化底物过程的13种不同功能中间状态的高分辨率（3.0~3.6埃）非平衡构象，通过时间分辨冷冻电镜分析，重建了受控蛋白酶体的完整动力学工作周期，并结合分子生物学功能和基因突变研究，阐明了USP14和26S相互调控活性的原子结构基础和非平衡动力学机制。
研究发现USP14的活化同时依赖于泛素识别和蛋白酶体RPT1亚基的结合。出人意料的是，USP14通过别构效应，诱导蛋白酶体同时沿着两条并行状态转变路径发生构象变化；课题组成功捕获到了底物降解中间状态向底物抑制中间状态的瞬时转化。在底物降解途径中，USP14活化变构地重编程AAA-ATP酶马达的构象景观（Conformational landscape）和统计分布，并刺激20S底物通道的打开，从而观察到底物持续转运过程的ATPase六聚马达非对称ATP水解和近乎完整的全周循环周期。
USP14-ATPase的动态相互作用，使得ATPase马达底物识别与26S自身的去泛素化酶RPN11催化发生去耦合效应，并在26S的泛素识别、底物的起始易位和泛素链回收过程中引入三个调控检查点（动力学分岔点）。这些发现为USP14调节26S的完整功能周期提供了全新的高分辨见解，并为USP14靶向药物治疗发现奠定了极为重要的机制基础。
图2. 通过时间分辨冷冻电镜分析获取的USP14调控蛋白酶体底物降解的并行路径模型。（Youdong Mao, CC BY 4.0）
这是首次将人工智能四维重建技术用于提升时间分辨冷冻电镜分析精度，针对重大疾病靶蛋白复合体，实现原子水平功能动力学观测的国际领先原创成果，展示了一类新型的蛋白质复合动力学研究范式。
Nature同期在线发表了专栏推介文章，评价该成果是一项重大研究，解决了原子水平USP14（泛素特异性肽酶14）活化和其调控蛋白酶体功能的机制问题。
相关论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8