本发明公开了一种构建多位点突变重组表达质粒的高效方法，包括如下步骤：将表达质粒pHAT2用双酶切方法采用两种限制性内切酶NcoI和XhoI酶切产生带有粘性末端5’‑CATG‑3’和5’‑AGCT‑3’线性片段，回收线性化质粒片段备用；PCR引物设计；进行三轮PCR反应得到突变表达载体；进行连接反应；构建突变表达载体。本发明具有突变率高、简单易行的特点。

该专利首次公开了三种偏甘油酯脂肪酶突变体及其制备方法,解决了偏甘油酯脂肪酶在实际生产及应用中所存在热稳定性差的国际性技术难题。专利技术在广东溢多利生物科技股份有限公司实施生产，开发形成系列浓缩复合酶产品，成功用于养殖、食品及造纸等行业中，成功出口东南亚、南亚、南北美洲、东欧和韩国、中国台湾、澳洲等多个“一带一路“沿线国家及地区，并被当地用户所普遍接受和认可。截至2017年12月，所开发的产品累计为企业带来销售额接近1.8亿元，利税近2700万元。获得了中国专利优秀奖和广东专利金奖。

该成果荣获2009年度重庆市自然科学奖一等奖,项目建成了世界最大和最丰富的家蚕突变基因资源库, 共保存遗传系统700余个，覆盖国际现存的95% ;新建立家蚕资源系统400个;发现新突变基因60余个，占 同期国内90%以上、国际70%以上。通过对重要突变基因资源的研究取得了重要创新结果，包括阐明65个新 突变基因的遗传模式，确定了50个的所属连锁群（染色体）,定位40个基因；建立了27连锁群的标记基因; 建立了230多个形态基因的连锁标记体系等。构建了世界第一套完整的家蚕近等位基因系，首次建立了3个重 要品系高纯度近交系，绘制了家蚕SADF. RAPD, AFLP. SSR等分子连锁图谱6张，构图分子标记2756 个，茧质性状QTLsll个，研究了一批重要突变基因的功能等。项目所取得的研究成果使我国家蚕遗传资源研 究整体上达到国际领先水平,并为我国蚕业科学研究提供了强大的资源支撑。目前每年有大约50个机构索取 基因库资源进行科学研究，年使用频率超过500份次。家蚕基因资源库建立和突变基因研究奠定了蚕学基础 研究、产业研发、高层次人才培养的重要基础，将对家蚕功能基因组学、实验生物和鳞翅目害虫模式等前沿 研究产生深远影响。

        我国精神疾病发病率高且增长趋势明显，是我国推进国民大健康战略所面临的巨大挑战。然而当前精神疾病临床诊断缺乏发病机制的依据，主要以临床表型为指标。多数精神疾病的发病原因与人体基因新发突变相关，这种不在父代而仅在子代发生的基因变异对精神疾病的临床诊疗极具重要性。         研发团队建立了从患者新发突变基因组学到转录组、蛋白组学的完整生物组学发病机制临床辅助诊断系统，填补了精神疾病临床诊断的组学机制评价空白，系统自动生成辅助诊断报告和用药风险分析，具有显著的临床应用价值，符合领域发展的国际行业趋势，具有巨大的市场推广潜力。         意向开展成果转化的前提条件：中试放大及产业化工艺开发资金支持

TK基因突变试验具有高度的敏感性，可检出包括点突变、大的缺失、重组、异倍性和其他较大范围基因组改变在内的许多遗传改变，长时间处理还可检出某些断裂剂、纺锤体毒物和多倍体诱导剂等。近年来，本团队在使用L5178Y细胞和TK6细胞系用于TK基因突变试验的标准化方面做了大量的研究工作，在国内外期刊上发表了多篇文章。并在国内负责制定/修订了TK基因突变试验标准，该标准在2003年第一次颁布，2012年开始修订，目前修订版将于2014年末正式颁布，作为《GB15193 食品安全国家标准—食品安全性毒理学评价程序》中体外遗传毒性重要的一项实验，对评价受试物的遗传毒性具有重要作用。

本发明涉及一类新型重组融合蛋白，其基本结构为{GLK}p-R-{GLK}q，其中R是有生物学功能的蛋白或多肽，GLK为重组明胶样蛋白(gelatin-like protein，GLK)，具有(Gly-X-Y)n明胶结构特征的蛋白序列。与未融合有GLK片段的原始蛋白/多肽相比较，这类重组明胶样融合蛋白具有更高的亲水性，在体内具有更长的半衰期。本发明也包括编码该融合蛋白的核苷酸序列，含核苷酸序列的表达载体，转化有该类载体的宿主细胞以及制备本发明所涉及的融合蛋白的方法。此外，还包含含有该类融合蛋白的药用组合物以及用于治疗、预防或缓解疾病的方法。

项目成果/简介:在中国癌症发病率和死亡率呈持续增长趋势，癌症的治疗效果不令人满意。肿瘤靶向药物是癌症治疗的新希望，具有方便、见效快的特点，在临床已表现出较大的优势，能显著改善患者的生存质量和延长患者的生存期，是癌症治疗的首先药物，但靶向药物的应用面临两个主要问题，一是靶向药物的适用性问题，其治疗效果与患者的基因突变类型密切相关，需要通过肿瘤患者的基因突变检测来筛选适用患者；二是靶向药物的耐药问题，一般靶向药物使用几个月即可出现耐药，可能产生新的耐药基因。因此盲目使用靶向药物，可能只对少数患者有效，治疗效果很差，而如果采用基因突变检测来指导靶向药物的个性化治疗，并且在治疗过程中通过对耐药基因的检测了解靶向药物的疗效变化进一步指导靶向用药，则患者的治疗效果可明显改善，同时可避免无效用药，节约社会成本。显然采用靶向药物的个性化治疗方案可使患者受益最多，但受现有技术检测灵敏度和特异性的限制该方案目前还难以实现。由于目前的基因突变检测灵敏度和特异性不够高，大都以肿瘤组织为检测标本，但很多晚期癌症病人不适合手术治疗无法获取组织样本，而细针穿刺等方法取样较痛苦，患者往往难以接受，另外，对于手术患者肿瘤组织样本难以再次取样获得，因此治疗监测过程中会出现无样可取的情况；同时由于检测灵敏度和特异性不够高，现有技术只能进行单一突变检测，不能同时检测多种点突变，由于突变种类较多，临床检测操作繁琐，工作量较大。本项目针对现有检测技术的缺点进行技术创新，采用特殊的TB-ARMS基因突变检测技术使基因突变检测灵敏度和特异性较现有技术提高十倍以上，从而可以血液样品为检测对象，并且可同时检测多种点突变，简化了操作流程，节约了成本。 本项目的目的是开发可以血液和组织样品为检测对象的高灵敏度和特异性的基因突变检测试剂盒，用于临床指导靶向药物的个性化用药，并将其推广应用。应用范围:与目前存在的基因突变检测技术相比，本项目所采用的检测技术具有更广泛的适用性。本项目所采用的技术以病人血液为主要检测标本，可适用于所有肺癌和结直肠癌病人。由于具有高度的灵敏度和特异性，可在高野生型基因背景下进行检测，解除了传统检测技术对病人标本的限制。血液标本采样简单方便，与手术穿刺相比，极大的减轻了病人痛苦，也降低了取样的成本，更容易得到病人的配合。对于继发性耐药的病人而言，使动态实时检测耐药基因称为可能。项目阶段:试验阶段效益分析:与目前存在的基因突变检测技术相比，本项目研究采用的基因突变检测技术具有更高的灵敏度和特异性，灵敏度可达到0.1％，即可在大于103个野生型基因的背景下检测到一个突变基因。本项目研究已在基因突变检测方面积累了一定经验，已完成了对EGFR和K-ras基因检测的实验室研发工作，前期的研究结果显示，采用本项目的技术方法检测EGFR 29种常见突变和K-ras基因8种常见的突变至少可达到0.1%的检测选择性，具有高度的灵敏度和特异性，并且可在同一反应中同时检测8种类型K-ras点突变，这是目前其他ARMS技术所无法达到的。并且采用本项目技术，我们进一步研发了针对肺癌和结直肠癌靶向治疗的EGFR C797S、braf、PIK3CA等突变检测的试剂盒，其中EGFR C797S突变检测试剂盒目前尚无上市产品，C797S为靶向药物治疗过程中产生的突变，可用于靶向药物的耐药监测，以便及时指导病人改变治疗方案。

在中国癌症发病率和死亡率呈持续增长趋势，癌症的治疗效果不令人满意。肿瘤靶向药物是癌症治疗的新希望，具有方便、见效快的特点，在临床已表现出较大的优势，能显著改善患者的生存质量和延长患者的生存期，是癌症治疗的首先药物，但靶向药物的应用面临两个主要问题，一是靶向药物的适用性问题，其治疗效果与患者的基因突变类型密切相关，需要通过肿瘤患者的基因突变检测来筛选适用患者；二是靶向药物的耐药问题，一般靶向药物使用几个月即可出现耐药，可能产生新的耐药基因。因此盲目使用靶向药物，可能只对少数患者有效，治疗效果很差，而如果采用基因突变检测来指导靶向药物的个性化治疗，并且在治疗过程中通过对耐药基因的检测了解靶向药物的疗效变化进一步指导靶向用药，则患者的治疗效果可明显改善，同时可避免无效用药，节约社会成本。显然采用靶向药物的个性化治疗方案可使患者受益最多，但受现有技术检测灵敏度和特异性的限制该方案目前还难以实现。由于目前的基因突变检测灵敏度和特异性不够高，大都以肿瘤组织为检测标本，但很多晚期癌症病人不适合手术治疗无法获取组织样本，而细针穿刺等方法取样较痛苦，患者往往难以接受，另外，对于手术患者肿瘤组织样本难以再次取样获得，因此治疗监测过程中会出现无样可取的情况；同时由于检测灵敏度和特异性不够高，现有技术只能进行单一突变检测，不能同时检测多种点突变，由于突变种类较多，临床检测操作繁琐，工作量较大。本项目针对现有检测技术的缺点进行技术创新，采用特殊的TB-ARMS基因突变检测技术使基因突变检测灵敏度和特异性较现有技术提高十倍以上，从而可以血液样品为检测对象，并且可同时检测多种点突变，简化了操作流程，节约了成本。 本项目的目的是开发可以血液和组织样品为检测对象的高灵敏度和特异性的基因突变检测试剂盒，用于临床指导靶向药物的个性化用药，并将其推广应用。

EGFR（表皮生长因子受体）是一种重要的肿瘤靶点，与多种恶性肿瘤的发生和发展有关。西妥昔单抗作为靶向EGFR的单克隆抗体药物在转移性结直肠癌的治疗中具有重要地位，其安全性和有效性已在临床上得到广泛验证，已从三线治疗药物跃居至一线治疗药物。 然而，在用药过程中EGFR胞外区耐药点突变的产生大大限制了西妥昔单抗的疗效，其中一些高频点突变如S492R、G465R可使西妥昔单抗完全失去结合EGFR的能力，患者用药后获益大打折扣。当前临床上仍缺乏有效的抗体新药应对EGFR胞外区点突变介导的西妥昔单抗耐药问题。 因此，探索高效率的抗体药物开发策略用于开发能够有效逆转EGFR胞外区点突变耐药的抗体新药，并应对临床上越发频现的因靶标受体发生点突变而导致的耐药是迫切需要解决的临床问题。 研究团队针对行业痛点开发了计算机辅助设计的抗体快速定向进化技术，发现西妥昔单抗可变区上的一个或两个点突变即可逆转多种EGFR的获得性点突变耐药，西妥昔单抗突变体可完全恢复对耐药点突变受体的结合能力，同时保留原有抗体的其他生物学功能（如CDC、ADCC），从而以最小改动最大限度保留了抗体突变体的成药性。该技术为临床上获得性点突变耐药提供了高效率解决方案，可极大加快抗体新药研发进程。

本发明提供了鉴定和定量低频体细胞突变的方法，特别涉及鉴定转座子基因组定位、方向和拷贝数的方法。本发明利用不同转座子家族的特异位点，通过构建文库灵敏、特异地富集转座子插入序列；利用高通量测序和生物信息学分析，准确地鉴定样本中转座子的基因组定位、方向、拷贝数和类型。使用本发明的方法能够经济地、精准地鉴定生殖系和体细胞转座子插入事件。此外，本方法可应用于检测任何序列已知区域内的低频遗传变异。在临床诊断应用方面，本方法在检测由转座子插入导致的遗传疾病上有重大潜力，并在理解体细胞嵌合突变的产生及其潜在致病性有重要意义。